【公开课】ABI 7500/7500Fast 程序实操指南及数据有效性分析方法

不知不觉开学已经一个多月了，相信科研小伙伴们也已经从理论学习进入了实操阶段。在面对摩拳擦掌准备一次就成功完成qPCR 实验的小白们，师兄师姐都难免嘱咐一句：“学习理论只是实验的第一步”，只有掌握实验操作中的关键点和qPCR仪的程序设定，才能够真正将理论转化为实践、获得完美的实验结果。

近期TIANGEN将与大家全面分享几种实验室常见荧光定量仪器的程序设定方法，并通过具体示例为您详解qPCR实验中的关键问题点，以及如何通过完善程序设置获得有效的实验数据。

荧光试剂主要包括两种：Taqman探针法试剂和SYBR Green I染料法试剂，由于两种试剂的作用原理不同，要根据实验目的选择合适的试剂。SYBR Green I染料法试剂主要用于相对定量研究，而探针法试剂主要用于病原微生物核酸检测或基因分型等方面的研究。

图片均可点击放大查看

若选用ABI 7500Fast仪器，升降温速度更快，40min左右即可完成反应，建议选择匹配的快速定量试剂（如FastFire qPCR PreMix (SYBR Green)，目录号FP207），会得到更理想的结果。

标准曲线可以分为两种，一种是绝对定量实验中用已知浓度标准品进行倍比稀释得出的标准曲线，另一种是利用未知浓度的cDNA进行倍比稀释得出的相对标准曲线。两种标准曲线都可以换算得出基因的扩增效率，不同之处在于前者主要用于检测未知样本浓度，后者可以辅助判断cDNA模板的稀释倍数。

在完成Target、Sample和生物学重复，以及内参基因（可以设置多内参基因）和参照样本设置的前提下，实验结束后软件会自动计算出目标样本相对于参照样本的目的基因表达倍数。

ABI的荧光定量仪器在qPCR反应时要加内参染料，这样可以校正反应孔之间的体系误差，得到更精确的结果。

反应程序可以在默认的程序基础上根据qPCR试剂建议进行修改，如果需要缩短延伸时间，可以在Expert Mode一栏去掉未使用的荧光通道。荧光信号的收集需要在PCR延伸期和熔解曲线（染料法qPCR）温度上升期进行。

为了提高操作的便利性，设置好的板面和反应程序可以保存为模板，运行时直接打开运行或者修改后运行。板面也可以在运行之后分析数据时设置。

扩增曲线主要看ROX荧光校正过的ΔRn vs Cycle图，包括linear图谱和log图谱。荧光阈值要设置在指数扩增期，此时模板的log值与循环数之间存在负线性关系，后续的分析结果才会更准确。

熔解曲线如果是单一尖锐峰，代表产生的是特异的产物；如果出现杂峰，代表产生了非特异扩增或者引物二聚体，而此时对应的Ct值是不准确的，不能用于后续分析。

标准曲线的参数主要看扩增效率、R²和线性化范围，扩增效率要在0.9-1.1之间，R²大于0.98，样本浓度落在线性化范围内，后续的分析结果才会更准确。