高唾液酸蛋白的 IEX 糖谱分析，助您获得更准确分析结果

2021-09-08 12:02:31, 安捷伦科技 安捷伦科技（中国）有限公司

糖基化作为非基因模板的酶促修饰反应，具有异质性等特点。随着中国药典 2020 年版对糖基化重要性的提出，因糖基化对药物特性有显著影响，所以控制糖基化以保障药物的安全、有效、质量可控是十分有必要的。

目前已上市的蛋白药物中糖蛋白药物占比大于 2/3。糖基化分析可以从完整糖蛋白水平、糖肽水平、游离寡糖水平和单糖水平进行。目前最常用的 HILIC-FLD/MS 同时也非常适合作为单抗 N-糖谱分析；传统 N-糖标记使用 2-AB 试剂，不过该方案仍有一些可以提升的空间：诸如前处理时间较长、质谱鉴定时灵敏度不够等。因此，一些搭配新型标记物的前处理试剂盒（如 Gly-X InstantPC ）正在慢慢被市场所接受。

还在把大量时间扔给 N-糖前处理嘛？听说最顶尖的实验室都用它
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图 1. Gly-X N-糖样品前处理工作流程。推荐的初始样品量为 1-40 μg，最大样品量高于类似工作流程。可能还可使用更多蛋白质，具体取决于分子。如需了解更多的样品考虑因素，请参阅具体的 Gly-X 产品手册
对于融合蛋白等唾液酸含量较高的糖型，HILIC-FLD/MS 法仍存在一定的不便：谱图过于复杂且无法获得合适的分离，因此 QC 放行标准难以确定。
图 2. 用 HILIC-FLD 法分析 InstantPC 标记的 EPO 游离 N-糖（上图：优化的梯度方法；下图：N-糖谱常规方法）
基于以上的问题，安捷伦参考中国药典 2020 年版三部中康柏西普注射液的糖谱分析法。对 EPO、FSH 和融合蛋白 3 种高唾液酸糖蛋白进行 N-糖谱表征：使用更高荧光响应的 InstantPC 快速标记游离 N-糖，依靠不同数量的唾液酸带电荷数不同在强阴离子交换（SAX）色谱上进行分离。
图 3. 采用离子交换色谱法分析高唾液酸蛋白 N 糖谱（样品从上到下分别是：EPO, FSH, 融合蛋白，IPC 标记的唾液酸标准品。唾液酸标准品洗脱顺序从早到晚依次是：NA4；NA4S1；NA4S2；NA4S3；A4）
对比 2020 年版中国药典中传统 2-AB 法的 Z 值， IPC 标记 Z 值落在同一区间内。通过对融合蛋白游离寡糖连续 6 针进样比对，可以发现该液相方法良好的重现性。
图 4. 融合蛋白连续 6 针进样叠加谱图
离子交换色谱方法
仪器： Agilent 1260 HPLC system with binary pump
色谱柱： Agilent Bio SAX, 4.6x250mm, NP5, PEEK, PN 5190-2467
流动相 A： Tris HCl buffer 10mM, pH 8.5
流动相 B： 流动相A+ 500mM NaCl
梯度运行
检测器 FLD
流速 0.6mL/min
总结
本文介绍了一种全新的高唾液酸化蛋白的 N-糖表征方法。使用 Gly-X 平台，可以简单快速地进行 N-糖前处理，搭配 InstantPC 染料，可以获得足够的荧光响应。与 HILIC-FLD 法不同，SAX 法表征的高唾液酸蛋白图谱简单，方法重现性良好，更易被常规 QC 中 UV 检测所接受。
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