恒光讲堂｜近红外二区：短波红外(SWIR)荧光分子成像用于癌症肿瘤的光学诊断

2021-08-16 13:32:04, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：近红外二区，短波红外(SWIR，1000-1400纳米) 区域的光散射和自荧光较低，因此比传统的可见光和近红外荧光成像具有更高的对比度和灵敏度以及更深的穿透深度，有望提供更高的信号与背景信号之比。

目前可用于生物医学应用的生物相容性SWIR荧光探针数量非常有限。在近红外和SWIR荧光探针中，吲哚青绿(ICG)是美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于临床的唯一荧光染料，在830纳米具有荧光最大值，也可以在SWIR区域发射，然而，只有少数关于ICG的SWIR荧光分子成像用于可视化活体系统中的癌性肿瘤的报告。在这篇论文中，作者描述了基于ICG的SWIR荧光分子成像用于小鼠肿瘤的光学诊断。

作者使用了四种类型的单克隆抗体：抗HER2抗体(Herceptin)、抗EGFR抗体(Erbitux)、抗VEGFR-2抗体(Cyramza)、和抗PD-L1抗体(anti-PD-L1 ab)制备了四种ICG-抗体共轭物，然后，应用基于ICG的SWIR荧光分子成像技术，对小鼠乳腺和皮肤肿瘤进行了高灵敏度的光学检测，发现设计的SWIR分子成像探针能特异性地积累到乳腺和皮肤肿瘤，并且它们的SWIR荧光图像(> 1000纳米)显示出比在830纳米拍摄的近红外肿瘤图像高1.5-2.0倍的对比度，由于其高对比度图像，尽管ICG的SWIR荧光发射远弱于其NIR荧光发射，但ICG-抗体共轭物对于尺寸小于几毫米的小肿瘤的SWIR光学检测具有足够的灵敏度，因此使用ICG-抗体共轭物的SWIR荧光成像能够定量分析肿瘤大小的变化。此外，作者的研究表明，使用ICG-抗体共轭物的SWIR荧光成像可用于阐明体内癌症特异性膜蛋白HER2、EGFR、VEGFR-2和PD-L1的表达水平。而且由于ICG从肿瘤发出的荧光辐射在一个月内保持稳定，应用 SWIR荧光成像能够定量分析抗癌药物Kadcyla治疗肿瘤的大小变化，进而评估抗癌疗效。最终，作者认为使用ICG-抗体共轭物的SWIR荧光分子成像有潜力用于医学和临床领域的癌性肿瘤的光学诊断。

首先，作为肿瘤靶向探针，作者分别用Herceptin、Erbitux、Cyramza和抗PD-L1抗体制备了四种ICG-抗体共轭物。（备注：鉴于细胞成像常规荧光显微镜在近红外区(< 700 nm)的灵敏度较低，作者使用发射可见光的Alexa488-抗体共轭物代替ICG-抗体共轭物）

图1 (a)染料的N-琥珀酰亚胺酯衍生物(Dye-NHS)与抗体结合的示意图。染料-NHS与抗体分子轻链和重链的氨基结合。(b)Alexa488和ICG结合Herceptin后的吸收光谱。

接下来，作者发现使用ICG-抗体共轭物的SWIR荧光成像可用于阐明体内癌症特异性膜蛋白HER2、EGFR、VEGFR-2和PD-L1的表达水平，对A431和KPL-4细胞进行了western blotting analysis（蛋白质印迹分析）(图2a)。结果显示，KPL-4细胞过度表达所有的蛋白质：EGFR，HER2，VEGFR-2和PD-L1，而A431细胞除了EGFR、VEGFR-2和PD-L1外，不过度表达HER2。对A431和KPL-4细胞进行荧光成像显示Alexa 488–Herceptin染色KPL-4细胞的膜表面，其荧光比A431细胞强得多(图2b)。在Alexa 488–Erbitux的情况下，A431和KPL-4细胞的膜表面都被染色(图2b)。这一观察与A431和KPL-4细胞的HER2和EGFR表达水平一致(图2a)。Alexa 488–Cyramza和Alexa 488–抗PD-L1 ab也对A431和KPL-4细胞膜进行了染色，尽管它们的荧光发射比Alexa 488–Herception和Alexa 488–Erbitux染色的弱(图S4)。细胞成像显示A431和KPL-4细胞在其细胞表面表达膜蛋白HER2、EGFR、VEGFR-2和PD-L1，尽管它们在A431和KPL-4细胞中的表达水平不同。

图2(a)A431和KPL-4细胞中HER2、EGFR、VEGFR-2和PD-L1表达水平的蛋白质印迹分析。(b)A431和KPL-4细胞用Alexa488-Herceptin和Alexa488-Erbitux染色后的荧光图像。

图S4：A431和 KPL-4 细胞用Alexa488-Cyramza 和 Alexa488-PD-L1染色后的荧光图像。

对制备的四种ICG-抗体共轭物的光学特性进行进一步的探索，作者发现ICG-Herceptin在1000纳米以上的SWIR荧光强度比其在830纳米的NIR荧光强度弱至少20倍。然而，ICG-Herceptin的SWIR荧光具有足够的强度，可以通过使用InGaAs CCD相机进行探测。ICG-Herceptin共轭物在水中的SWIR荧光量子产率约为0.5%。图3b显示了含有ICG-Herceptin水溶液(2 μM)的毛细管的SWIR荧光图像。这些图像是用波段滤光片(1000±15纳米，1100±15 nm和1300±15纳米)，其中ICG的激发波长被设定为785纳米。尽管ICG-Herceptin的SWIR荧光强度随着检测波长的增加而降低，但其SWIR荧光可在1000-1300nm的波长范围内被检测到。为了检查SWIR区域的光散射，我们检测了通过琼脂糖凝胶的SWIR荧光。图3c显示了ICG–Herceptin (2μM)的NIR和SWIR荧光发射的比较。这些图像是用含有ICG-Herceptin水溶液的毛细管(直径0.5毫米) 拍摄的，其荧光穿过包含脂肪乳剂的1%琼脂糖凝胶(厚度:0、1和2毫米)。由于散射，ICG-Herceptin的近红外荧光图像随着琼脂糖凝胶厚度的增加而模糊，相比之下，ICG-Herceptin的SWIR 荧光图像不那么分散，因此与在NIR区域拍摄的荧光图像相比，荧光图像更清晰。SWIR荧光图像的半峰全宽比NIR荧光图像的小三倍(图3c中的下图)。与凝胶中的NIR荧光相比，SWIR荧光的散射更低，因此图像更清晰。尽管ICG的SWIR荧光与其NIR荧光相比非常弱，但由于SWIR区域的组织散射和自荧光较低，SWIR荧光图像的信号与背景对比度较高(图3c)。

图3(a)ICG-Herceptin的激发和发射光谱。(b)充满ICG-Herceptin的毛细管的SWIR荧光图像。(c)填充有ICG-赫赛汀的毛细管的近红外荧光(830纳米)和SWIR荧光(> 1000纳米)图像，荧光穿过含有1%脂肪乳的琼脂糖凝胶(厚度:0、1和2毫米)。下方图片显示了穿过2 mm厚度的琼脂糖凝胶的SWIR图像的强度分布。

然后，作者在小鼠中使用ICG-抗体共轭物进行了近红外和SWIR肿瘤成像，发现SWIR肿瘤成像中的信号与背景对比度比近红外肿瘤成像好1.5-2倍。通过将人乳腺肿瘤细胞(KPL-4)31植入裸鼠来制备乳腺肿瘤承载小鼠。肿瘤的直径约为5毫米(图4a)。在向携带乳腺肿瘤的裸鼠的尾静脉注射ICG-Herceptin后的第0、1和3天拍摄NIR和SWIR荧光图像(图4b)。注射ICG-Herceptin后，立即从肝脏观察到ICG的强荧光信号，而从乳腺肿瘤仅检测到弱荧光信号。注射ICG-Herceptin一天后，清晰地观察到乳腺肿瘤的NIR和SWIR荧光。注射后三天，大部分ICG-Herceptin积聚到乳腺肿瘤，导致肿瘤产生强烈的荧光效应。为了研究ICG-Herceptin在乳腺肿瘤中的主动积累，进行了一项使用ICG-正常IgG的对照实验。在这种情况下，与注射ICG-Herceptin的小鼠相比，没有从乳腺肿瘤中观察到明显的SWIR荧光 (图4b中的右图)。注射后三天肿瘤的NIR和SWIR荧光图像的比较显示，SWIR肿瘤图像的信号对背景(S/B)对比度比NIR肿瘤图像高1.5倍(图4c)。SWIR 荧光图像中的低背景信号(图4b)是由SWIR区域中的低组织自荧光引起的，此外，我们检查了被其他类型的分子成像探针染色的乳腺肿瘤的图像对比度的差异，ICG-Erbitux、ICG-Cyramza和ICG-抗PD-L1偶联物(图4d)。在所有情况下，SWIR荧光图像的信噪比比NIR荧光图像高1.8-2.0倍。

图4 (a)带有乳腺肿瘤的裸鼠的明场图像。红色圆圈表示乳腺肿瘤的位置。(b)尾静脉注射ICG-Herceptin后裸鼠的近红外(830纳米)和SWIR (>1000纳米)荧光图像。右图显示了小鼠乳腺肿瘤的离体SWIR荧光图像，其中小鼠静脉注射ICG-Herceptin和ICG-正常IgG。ICG-正常的IgG被用作阴性对照。(c)乳腺肿瘤的SWIR和近红外荧光图像的信噪比。(d)注射ICG-Erbitux、ICG-Cyramza和ICG-PDL1抗体三天后拍摄的乳腺肿瘤的近红外和SWIR荧光图像。

为了评估SWIR荧光对肿瘤的检测灵敏度，我们对不同大小的乳腺肿瘤(直径约2毫米至8毫米)进行了SWIR荧光成像。注射ICG-Herceptin三天后，拍摄乳腺肿瘤SWIR荧光图像(图5a)。接下来，我们评估了检测肿瘤特异性膜蛋白表达水平的检测灵敏度。对带有大小相似的皮肤和乳腺肿瘤的裸鼠进行SWIR荧光成像。如图5b所示，使用ICG-Herceptin的SWIR荧光成像显示，乳腺肿瘤的荧光强度比皮肤肿瘤高约3倍(图5b中的左图)。这一结果表明，与皮肤肿瘤相比，HER2在乳腺肿瘤中的表达更高。使用ICG-Erbitux的SWIR荧光成像显示EGFR的表达水平在两种不同的肿瘤中是相似的(即图5b中的右图像)。这些观察结果与A431和KPL-4细胞的蛋白质印迹分析结果一致(图2a)。因此，使用ICG-抗体共轭物的SWIR荧光成像对于检测肿瘤中膜蛋白的不同表达水平具有高灵敏度。

图5 (a)不同大小的乳腺肿瘤(直径2毫米至8毫米)的明场和SWIR荧光(> 1000纳米)图像。红色的虚线圆圈表示乳腺肿瘤的位置。(b)带有乳腺肿瘤(KPL-4)和皮肤肿瘤(A431)的裸鼠的明场和SWIR荧光图像。

接着，为了对肿瘤血管生成进行双色SWIR荧光成像，作者使用了两种类型的SWIR荧光探针：ICG-Herceptin和PbS量子点(QDs)。首先，将ICG-Herceptin静脉注射到患有乳腺肿瘤的小鼠体内。三天后将ICG-Herceptin注射液、谷胱甘肽包埋的水分散性PbS QDs静脉注射给荷瘤小鼠。注射PbS量子点后，立即进行双色SWIR荧光成像。通过使用ICG (ex:785nm)和PbS QDs (ex:975 nm)的SWIR双色荧光，肿瘤和新生血管分别在SWIR区域可视化(图6)。应该注意的是，小肿瘤(直径约4mm))中的新生血管存在于肿瘤的外围(图6a)，而大肿瘤(直径约10毫米)的新生血管存在于肿瘤的外围和内部(图6b)。这些结果表明双色SWIR荧光成像能够光学检测肿瘤以及肿瘤血管生成。

图6裸鼠乳腺肿瘤和新血管的双色SWIR荧光图像。肿瘤直径约为4毫米(a)和10毫米(b)。乳腺肿瘤用ICG-Herceptin染色。来自肿瘤的SWIR荧光(青色)通过785纳米的激发在1000纳米以上的波长被检测到。通过小鼠尾静脉注射谷胱甘肽包埋的PbS量子点来观察新血管。新血管的SWIR荧光(红色)是通过975纳米激发在1300±15纳米检测到的。

最后，作者发现使用ICG-抗体共轭物的SWIR荧光成像有可能应用于人类癌症肿瘤的光学诊断。图7展示了使用抗癌药物(Kadcyla)（恩美曲妥珠单抗）治疗乳腺肿瘤(KPL-4)肿瘤缩小的时间历程SWIR荧光成像。Kadcyla是一种用于HER2阳性癌症治疗的抗体-药物共轭物，Kadcyla含有抗HER2抗体(Herceptin)， HER2阳性乳腺肿瘤用ICG- Herceptin (0.2毫克)染色。注射ICG- Herceptin两天后，乳腺肿瘤的SWIR荧光清晰可见，肿瘤直径约为5毫米(图7)。在用Kadcyla (0.2 mg)治疗的带有乳腺肿瘤的小鼠中，肿瘤大小明显减小(图7a和S8 ):在注射Kadcyla的第9天后，肿瘤大小减小到直径约2 mm。这一结果表明， Kadcyla治疗可以诱导HER 2阳性乳腺肿瘤细胞凋亡。相比之下，在未经Kadcyla治疗的小鼠中，乳腺肿瘤的大小逐渐增大 (图7b)。

图7：用(a)和不用(b)Kadcyla(0.2毫克)治疗的乳腺肿瘤的SWIR荧光(> 1000纳米)图像。在注射ICG-赫赛汀两天后， Kadcyla被静脉注射到患有乳腺肿瘤的小鼠体内。这些图像是在注射Kadcyla后0、3、6和9天拍摄的。在Kadcyla治疗后，对9天的小鼠拍摄乳腺肿瘤的离体明场图像。

参考文献

Setsuko Tsuboia and Takashi Jin. Shortwave-infrared (SWIR) fluorescence molecular imaging using indocyanine green–antibody conjugates for the optical diagnostics of cancerous tumours[J]. The Royal Society of Chemistry,2020, 10, 28171–28179

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