2021-06-29 17:44:43 上海仪电分析仪器有限公司
本方法以L-赖氨酸和L-蛋氨酸为例,对饲料等样品中十几种氨基酸的测定方法做一简要介绍。
一、方法原理
对氨基酸进行柱前衍生后,在254nm波长下,以保留时间定性,采用外标法分析时,需做标准曲线,无需加入正亮氨酸内标物。
二、所需仪器和试剂
仪器:
a.高效液相色谱仪含紫外检测器
(上海仪电分析仪器有限公司LC220);
b. 蒸发回流装置;
c.万分之一天平;
d.恒温水浴锅;
e.实验室常用玻璃仪器。
试剂:
a.L-赖氨酸和L-蛋氨酸标准品;
b.甲醇(色谱纯);
c.乙腈(色谱纯);
d.醋酸钠(分析纯);
e.乙酸(分析纯);
f.正己烷(色谱纯);
g.盐酸(分析纯);
h.苯酚(分析纯)。
三、实验方法
2.试剂配制
6mol/L的盐酸溶液:将盐酸溶液(36%-38%)与超纯水等体积混合,混匀;
0.1mol/L的盐酸溶液:取8.3mL盐酸溶液(36%-38%),用水定容到1000mL的容量瓶中,混匀;
0.1%苯酚的6mol/L的盐酸溶液:移取20μL苯酚,加入20mL6mol/L盐酸溶液中,混匀。
2.2 混合标准品溶液的配制
准确称量赖氨酸、蛋氨酸标准标准品配制成2.5μmol/mL的赖氨酸、蛋氨酸标准溶液,用0.1mol/L的盐酸溶液稀释成2.5、1.25、0.5、0.25、0.125μmol/mL系列浓度绘制标准曲线,4℃冷藏保存。
三乙胺溶液:准确吸取1.4mL三乙胺至10mL容量瓶中,用乙腈定容,摇匀,即得;
异硫氰酸苯酯溶液:准确移取250μL异硫氰酸苯酯至10mL容量瓶中,用乙腈定容,摇匀,即得。
3.样品处理
准确称取0.1000g样品于50mL圆底烧瓶中,加入10mL0.1%苯酚溶液溶解,110℃条件下加热回流24h,反应完成后,冷却,转移到100mL容量瓶中,定容。量取50mL溶液蒸干,用水定容至2mL,待衍生。
准确量取水解后溶液及氨基酸标准品0.2mL,分别置于1.5mL离心管中(内标法需往每支离心管中准确加入正亮氨酸内标50μL),然后分别加入三乙胺乙腈溶液0.1mL和异硫氰酸苯酯乙腈溶液0.1mL,摇匀室温静置衍生1小时。衍生结束后分别加入0.4mL正己烷,密封后剧烈振荡5~10s,静置分层,取0.2mL下层溶液和0.8mL水混合,过0.45μm有机系针式过滤器,待上机分析。
四、实验结果
蛋氨酸标准曲线
y=289746.8125x-8752.5,R=0.9996
赖氨酸标准曲线
y=478883.6875x-426.25,R=0.9998
4.结果计算
备注:
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