“药说”丨DART ‘噗’一下，药性须臾知

新冠诊疗方案（试行第八版）明确，新冠肺炎属中医“疫”病范畴，继推使用连花清瘟等中医药方案辨证论治。

植物药用于治疗慢性病方兴未艾。植物药方剂可能通过多种有效成分作用于疾病靶标，为疑难杂症的治疗提供广阔前景。

多个

尽管潜力巨大，人们对植物药成分及其生物活性还知之甚少，尤其对其安全性和疗效稳定性心存疑虑。天然产物成分繁杂，自生药种植、成药炮制及制剂生产阶段若缺乏良好的质控和标准，植物药最终疗效会大相径庭。因此，质控对确保植物药的安全性、有效性和一致性至关重要。

当前质控方法包括通行的化学分析（Chemical）和新兴的生物分析（Bioanalytical），还无法满足近来对通量、灵敏度尤其是快速的需求。

浙江大学程翼宇教授课题组近期开发了一种基于实时直接分析的（DART-MS）原位质谱平台，用以多维度评估生药质量和同时分析其多重化学成分与活性。

图1、使用 MS 敏感探针和 DART-MS 对植物药进行多维质量评估的总体流程。分别通过 MS 指纹分析和双酶分析，同时快速检测多组分及活性。

DART-MS 是使用最为广泛的原位质谱技术之一，采用最少的样品量和最为简单无感的预处理实现直接快速检测，已成为食品、法证、农业、环境、制药及天然产物表征和质量控制领域的新兴工具。

丹参注射液（DSI），是一种广泛用于心脑血管疾病的中药方剂。研究表明其通过抑制几种关键酶如凝血酶和血管紧张素转化酶（ACE）的活性发挥其治疗作用，本研究选择此两种靶标酶作为生物标志物开发原位质谱双酶测定法。结果表明，DART-MS 平台可以灵敏、可靠、高效地检测化学成分及其生物活性，突出表现了其在植物药质量评估中的巨大潜力。

仪器设置

DART SVP 离子源（IonSense）与 API 4000三重四极杆 QQQ-MS（AB SCIEX）耦合，氦气用作载气，氮气为备用气。

负离子模式，用于指纹谱分析；

DART 出口电压-150 V

温度400°C

正离子模式，用于酶促测定；

DART 出口电压+100 V

温度400°C

化学成分检测

负离子模式下检出丹参注射液中34种活性成分。丹参注射液的 DART-MS 指纹图谱如下图：

图2、丹参注射液中检出的34种化学成分

图3、30个批次丹参注射剂的主成分分析（PCA），除第26批次外，其余29个批次具有高度的化学成分一致性。

样品第26批次中含有的与糖类有关的离子强度远高于平均水平，而与酚酸相关的离子强度相对较低。通常，在 DSI 生产当中需通过乙醇沉淀去除糖类，以限制5-羟甲基糠醛（具有潜在毒性的糖类脱水产物）的产生，在此过程中酚酸自然浓缩（离子强度较高）。考虑到糖类成分与药效及安全性的关系，样品第26批次中的成分异常应引起关注。

生物活性评价

采用可裂解质谱探针作为酶促底物的多重酶测定法来完成生物活性的评估。这些标记有哌嗪分子的探针，可灵敏重现、定量测定酶活性。

研究团队在 Tris-HCl 缓冲体系中，加入 ACE 酶和其底物 PP-DSDKP*，实验样本中加入丹参注射液，而空白样本则用 Tris-HCl 缓冲液代替。实验通过检测 ACE 酶和其底物 PP-DSDKP* 反应后的产物 PP-DSD* 的含量差异，来评估丹参注射液的酶抑制率。无需洗脱缓冲液，直接进样，酶抑制效率的计算方法如下：

其中 Pinhibitor 和 Pblank 分别为含丹参注射液的样本和空白样本中产物 PP-DSD* 峰面积。利用 PP-DSD* 的特异性峰 m/z 482，最低定量限（LLOQ）可低至 ppb级别，49 ng/mL（S/N=10）。

用同样的方法，评估丹参注射液对凝血酶的抑制作用。

图4、正电离模式，酶促底物及其酶产物的 DART-MS 谱图。其中，（B）为 ACE 酶和其底物的反应产物 PP-DSD* 质谱指纹图。

本实验共对30个批次丹参注射液进行了酶抑制效率评价。其中，丹参注射液对 ACE 酶抑制效率为28-41%，均值33%，批次间 CV 9.5%；对凝血酶抑制率为20-30%，均值24%，批次间 CV 9.2%。

图5、通过双酶分析评估丹参注射液的生物活性：（A）30个批次丹参注射液对 ACE 酶和凝血酶的抑制效率；（B）ACE 和凝血酶抑制作用之间的线性相关性。

化学成分与酶抑制作用相关性分析

通过多元线性回归分析（Multiple linear regression），发现丹参注射液中迷迭香酸（20号峰），原儿茶醛（14号峰），丹参素（5号峰）和丹酚酸B（33号峰）与 ACE 酶抑制效率正相关；而迷迭香酸（20号峰），迷迭香酸与丹参素复合物（30号峰）和咖啡酸（3号峰）与凝血酶抑制效率高度相关。这些发现与已发表的丹参生物活性研究高度吻合。

研究证明，生物标记与 DART-MS 原位质谱结合用于植物药质量多维测量可行。通过适当优化，可分钟内实现并行指纹识别和酶促分析。此外，标记有1-（2-嘧啶基）哌嗪的 MS 探针可实现酶活性的高敏多重检测。该法已成功用于有效评估丹参注射液的质量。本研究不仅构成了对植物药质量控制体系的宝贵补充，更可在将来扩展应用于诸如双靶抑制剂筛选和基于原位 AIMS 的天然产物的筛选。

*注：本文中 PP-DSDKP 和 PP-DSD 分别为被1-(2-嘧啶基)哌嗪(1-(2-pyrimidyl) piperazine，简称 PP）标记的 Asp-Ser-Asp-Lys-Pro 和 Asp-Ser-Asp 肽段。PP 能够有效提高离子化效率。

● 参考文献：

Zhenhao Li, Yi Wang, Yiyu Cheng. Mass Spectrometry-Sensitive Probes Coupled with Direct Analysis in Real Time for Simultaneous Sensing of Chemical and Biological Properties of Botanical Drugs. Analytical Chemistry 2019, 91 (14), 9001-9009.

https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b01251

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