FastFLIM™快速荧光寿命成像方式

2021-05-28 11:24:49, Archer 北京培科创新技术有限公司

“ 美国ISS——全球唯一同时提供时域TCSPC和数字频域FastFLIM™两种荧光寿命成像技术解决方案！”

市场上荧光寿命的测量方式可分为时域法和频域法，两者在本质上是相通的，测量精度相近，频域技术是时域法的傅里叶变换的延伸。

在时域寿命测中，通常利用脉冲光源对样品进行激发，由快速响应的检测器及电子装置采集发射光子，通过同步激发脉冲和检测器可以直接记录荧光衰减，通过对衰减数据的分析直接获得寿命信息，衰减数据的精度主要取决于激光脉宽及检测器和电子采集装置的响应时间。

频域技术采用可调制强度的连续光源，通过测量发射信号相对于激发信号的相移和振幅调制，对相移和振幅调制分析得到寿命信息，测量精度取决于调制频率。频域法荧光寿命成像技术最早在1959年出现。生物领域里用的荧光标记的荧光寿命一般在纳秒级，测量上需要很精密的仪器，二十年前这些还仅局限于比较先进的物理实验室里。

传统的频率技术和时域技术最大的差异是在于光源（时域采用脉冲光源，频域技术采用连续光源）；输出数据形式不同；（时域直接输出衰减曲线，频域是相位移或模位移），不过这些印象随着技术发展已经完全改变了。

由于近二十年里荧光技术和光电工业的飞速发展，特别是各种快速响应检测器的出现，比如增强型CCD相机，条纹相机，高灵敏度快速响应的光电倍增管光子计数检测器等等，极大推动了寿命成像技术的发展。简单易操作的荧光寿命成像系统已经完全商业化。时域和频域技术在各种显微寿命成像平台中都有应用，时间相关单光子计数方法（TCSPC )是最为常见的时域技术，而新兴的数字频域技术（FastFLIM™ )则取代了传统的模拟频域技术，凭借其独恃的优势成为应用最广的频域技术。

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模拟频域技术原理简介

利用调制光源对样品进行激发，其调制频率（ω）由所测的荧光寿命决定，比如测量纳秒寿命通常用兆赫频率；而同时也对检测器进行在相同频率上（零差法）或略微不同频率（外差法）的调制来检测发射光信号。由于荧光寿命所导致的延迟，检测到发射信号相对于激发有一个相位上的延迟φ和振幅上的解调（m = [AC_EM/DC_EM]/[AC_EX/DC_EX]），如果是单指数衰减，寿命可通过φ或m直接计算出来： τ=[tanφ]/ω=[1-m²]^1/2/[mω]；对于多指数衰减，需要在不同调制频率下测量φ和m，通过拟合分析得到寿命。

在传统的模拟频域测量中，利用调制光源对样品进行激发，其调制频率（ω）由所测的荧光寿命决定，比如测量纳秒寿命通常用兆赫频率；而同时也对检测器进行在相同频率上（零差法）或略微不同频率（外差法）的调制来检测发射光信号。上图即为一个采用正弦调制的模拟频域测量的描述及例子。

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新型FastFLIM™原理简介

模拟频域技术对激发光源和检测器的硬件要求比较低，同时也可达到皮秒级测量精度，但对于多指数衰减的测量，需要在不同调制频率下对样品进行重复测量，在很大程度上限制了其数据采集的效率。而这一问题被Gratton博士领导的LFD实验室所发明的最新数字频域技术（FastFLIM）完美的解决了。

利用脉冲光源代替调制光源对样品进行激发；发射光子通过光子计数检测器接收，不对检测器进行调制，而是通过FastFLIM对接收的光子信号进行数字转换并记录到代表不同相位的采样窗口，其采样频率fs由FastFLIM根据激发频率fex而生成，两者的差值称为互相关频率fcc，其倒数（1/fcc）正是相位采样的时间窗口；通过对接收光子的累积而生成相位直方图（cross correlation phase histogram）；通过对相位直方图的数字傅里叶变换处理可以得到在激光重复频率及多个倍频下的相位延迟（φ）和振幅解调（m），用于单指数或多指数的荧光寿命分析。

FastFLIM的独特优势

高效快速的数据采集模式（100%duty cycle），几乎无死亡时间；
光子计数动态范围大，线性度高，数据采集率可达每秒计数6x10⁷；
提供四个数据输入通道，同时对四个检测器进行并行数据采集；
灵活度高，应用范围广，100ps到100ms的无间断寿命测量；

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新型FastFLIM™功能强大、灵活方便、应用广泛

FastFLIM是基于现场可编程门阵列（FPGA )开发的全新的数字技术，具有很强的灵活性，操作方便，完全由电脑软件操控，同时适用于很多显微成像应用。在荧光强度成像应用中，FastFLIM光子计数采集模式提供了很高的信噪比，而其高效快速的采集模式保证了很大强度动态测量范围。在荧光相关成像应用中，FastFLIM可提供光子计数、时间标记、时间分辨时间标记（TTTR）三种模式的数据采集，可同时测量多个光物理参数。在寿命成像应用中，FastFLIM可实现100ps到100ms的无间断寿命测量，无需任何硬件的改动。

对于短寿命的测量，用户可通过加载不同的FastFLIM的驱动来调控脉冲激光的重复率，以获得最佳的衰减测量时间窗口；对于长寿命的测量，用户可实时改变FastFLIM输出的触发信号宽度及占空比来调制或门控激光，获得适合的衰减测量时间窗口。

FastFLIM -多样的寿命数据分析方法

FastFLIM采集的数据同时包括时域和频域的信息，VistaVision软件对其寿命数据提供了三种基本分析方法：

频域上的基于非线性最小二乘法的循环去卷积拟合分析；
时域上的基于非线性最小二乘法的循环去卷积拟合分析；
最新寿命直读矢量分析法。通过寿命直读矢量分析法，用户可以直接从FastFLIM采集的原始数据获取寿命信息，对寿命的变化进行实时跟踪；

北京大学分析测试中心关妍博士提供

这一特点对需要快速寿命信息反馈的应用具有非常重要的意义，对测量荧光能量共振转移（FRET )的应用有很大的帮助，如下面右图所示，FastFLIM采集的FRET寿命成像，原始数据通过Phasor Plots表达，无需拟合，便可直接区分表达于活细胞里的不同的FRET荧光蛋白结构体：Cerulean（C）是FRET给体；Venus（V）是FRET受体；C5V、C32V、CTV分别是两个荧光蛋白由5个、32个、229个氨基酸连接而成的结构体。

弗吉尼亚大学Keck中心Dr. AmmasiPeriasamy提供

美国ISS.Inc简介

美国ISS公司建立于1984年，致力于通过设计开发高灵敏度科研检测设备，服务于创新性研究，医学临床和工业应用。1985年ISS公司推出世界首款商业化多频相荧光计（Multifrequency Phase Fluorometer）GREG200™。ISS创新性设计的荧光分析设备长期应用于生命科学，分析化学，材料科学和基础物理化学研究，得到世界各地科研机构的广泛认同。我们的荧光分析设备产品线覆盖稳态荧光光谱仪，瞬态多重衰减荧光光谱仪，荧光显微镜，激光扫描共焦显微镜，荧光相关光谱仪和单分子探测粒子追踪系统。

1985	世界首款商业化多频相荧光寿命光谱仪(MPF)，GREG200™
1987	安装第一台使用谐波锁模激光器的MPF
1989	世界第一台全自动多频相荧光寿命光谱仪，K2™
1991	第一台使用数字滤片隔离交互相关频率的多频相荧光计，客户可自选交互频率；K2™ FastScan™ 通过激光器或者灯源作为激发光源，可在1分钟内获得时间分辨荧光光谱数据。
1992	第一台装备二极管阵列多频相荧光计，可同时获得多频率多波长荧光数据。
1998	引入第二产品线OxiplexTS™生物组织血氧计，双通道，非侵入式频域组织血氧计。
1999	Alba™，荧光相关光谱系统。
2001	ChronosFD™，激光二极管和LED作为激发光源的荧光寿命光谱仪。
2003	Alba™ 配置单光子和多光子共焦成像能力（稳态和寿命测量下）
2008	ChronosBH™荧光寿命光谱仪，基于激光二极管和LED激发，使用时间相关单光子计数法（TCSPC）技术。
2011	FastFLIM™，数字频域技术 (DFD)荧光显微镜
2015	MetaOx™组织氧代谢监测仪

ISS具有多年创新传统，并持有频域相关设备核心专利技术，使其在世界范围内成为频域时间分辨荧光光谱仪设备的世界领导者！ISS公司在荧光光谱领域开发了一系列可交互附件设备，可覆盖不同应用领域；模块化结构设计，允许用户定制化升级设备，以达到最优实验测试能力。北京培科创新技术有限公司作为ISS国内合作伙伴，建立了良好的战略合作关系，不断优化提升的公司自身营运和服务质量，致力于向用户提供国际一流的产品、最优化的解决方案和高品质的专业服务，承担着科技产业助推器的责任，服务并推动科学研究和科技产业的发展。

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