【干货】如何快速获得高效准确的qPCR扩增效率

理想的PCR反应，遵循DNA的半保留复制原则，那么理想的PCR扩增产物数量Xn，应该等于起始模板量X₀乘以2ⁿ（n是扩增循环数）（公式1）。但是实际扩增中，会存在各种因素影响导致模板量不能达到百分之百扩增，必须引入一个扩增效率En（公式2），反映其真实的扩增结果。

在指数扩增期，公式2成立，当产物量达到荧光阈值时，循环数是Ct，此时满足下面的关系（公式3），把公式3进一步推导可以得出Ct和模板量X₀的关系（公式4）。

在实际荧光定量实验中，En要在90%到110%之间，在相对定量实验中，如果选用2^-ΔΔCt来计算相对表达倍数，那么目的基因和内参基因的扩增效率除了要满足90%-110%条件外，其差值也要保持在10%之内，后续的定量结果才更准确。

● 扩增效率为什么会高于100%？

理论上来讲，按照DNA的半保留复制原则，扩增效率最高为100%。而实际上我们是通过荧光值的强弱来代表产物量的多少，而荧光值也会受到其他因素影响（比如：形成的引物二聚体也会产生荧光值，造成真实值虚高），另外实验的各个环节中都会存在系统误差，因此导致了扩增效率高于100%，这也是正常现象。

● 扩增效率高于110%？

① 形成非特异扩增或引物二聚体

--调试合适的反应体系和条件（比如适当降低Mg²⁺浓度或适当提高退火温度、适当提高模板量，降低引物浓度）

--选择扩增特异性强的定量试剂

--重新设计引物

② 体系发生了污染

--设置NTC监测体系是否存在污染

--操作过程在超净台中进行，避免引入环境污染

--注意试剂的取用和保存，避免交叉污染

● 扩增效率低于90%？

① 扩增片段长，复杂模板

--扩增片段在80-200 bp之间，不要太长，尽量避开复杂结构

--选择抗逆性强的定量试剂

② 反应体系条件或者引物设计不合适

--调试合适的反应体系和条件（比如适当增加Mg²⁺或DMSO浓度）

--优化引物设计

③ 反应成分降解或含有抑制剂干扰

--各成分（模板，定量试剂，引物等）合理保存，避免反应成分降解

--重新制备高纯度的模板

--选择抗抑制性强的定量试剂

● 如何得到准确的扩增效率？

准确的扩增效率计算来源于准确的标准曲线制作，主要需要注意以下几方面：

--标准品和模板制备过程中的准确稀释

--各反应成分妥善保存，防止降解

--小心操作，增加技术重复，配制预混mix，以提高数据的重复性