显微成像小课堂 - 显微镜是如何记录图像的

无论是最常规的显微镜，还是活细胞工作站，共聚焦显微镜，在获得高分辨率的放大的像后，如何将它们记录下来，这就是今天这节课的主要内容

检测器

现代对活细胞培养的成像主要依赖于电子区域阵列探测器，如CCD相机，以及高增益点源探测器，如光电倍增管（PMT）。尽管在结构细节上有所不同，数码相机和光电倍增管都是基于一个共同的原理构建的模拟传感器。光子撞击到光敏基板上，被转换成光电子，并最终以模拟电流或电压的形式读出。将信号数字化，是通过在指定时间段连续估算电流中的电子数，创建光强度的相对量度，而不受存储模拟数据固有的噪声累积的影响。通过将采样时间与阵列元件或扫描光束的位置相关联，强度值在空间上相互关联重构出样本的图像。用户可定义的检测器设置通常包括曝光时间、读出率、增益、补偿，以及选择一个感兴趣的区域（阵列的一部分）进行读出。

在所有电子检测器中，当光子撞击检测器表面的活性基底材料时，就会产生信号。曝光时间和照明强度决定了生成图像的光子数量。将光子转换为光电子的效率取决于探测器表面能感知光子的部分（在CCD中称为填充因子）与基板的量子效率。量子效率定义为成功转换的光子数与撞击基板的光子总数之比。此外，检测器材料不可避免地会产生一些假电子，这些电子被称为暗电流。在需要长时间曝光时，冷却图像传感器，通常在-20到-80摄氏度之间，可以抑制暗电流。

在被检测器收集后，信号和暗电流电子被读出到一个模数转换器（ADC）。读取电子输出会产生一种被称为读出噪声的伪影，这种伪影要么来自热产生的电子，要么来自小的计时误差，而且与读出速度成正比。除光子计数的统计性质以外（指的是散粒噪声），暗电流和读出噪声共同构成了图像记录过程中的主要噪声源。许多数码相机的驱动软件允许选择读出放大器的速度，通常以兆赫（MHz）或像素每秒为单位。选择更快的读出帧速会降低信噪比。在共聚焦显微镜中，相对于光电倍增管的采样时间，光束扫描速度通常可以改变，以增加向转换器读出的信号。

成像系统通常使用三种基本的CCD结构：全幅传输、帧传输和隔行传输（如图5）。全幅图像传感器（图5（a））的优点是几乎100%的表面是光敏的，尽管在读出过程中必须防止入射光（通常使用电动机械光闸）。帧传输CCD（图5（b））的运行速度比全幅传输快，因为曝光和读出可以同时进行。尽管在结构上类似于全幅图像传感器，但矩形像素阵列的一半被一个不透明罩覆盖，用作优先读出光电子的存储缓冲器。相比之下，隔行传输CCD（图5（c））在整个阵列上包含用于成像的像素列以及屏蔽的用于存储的传输像素列。由于电荷转移通道紧邻每个光敏像素列，因此存储的电荷只需移动很短的距离，从而使这些芯片的读出最快。大多数彩色和单色制冷相机都配备了隔行传输图像传感器，但是，更先进的电子倍增CCD（下文讨论）通常使用帧传输图像传感器。

模数转换器在严格控制的时间间隔内对传感器读出进行采样，并与读出放大器同步。这个阶段是光电子和噪声电子从检测器转换成灰度或强度值的阶段。模数转换器的输入范围限制了饱和（白色）前的电子总数，并定义每个灰度所需的电子数。位深是指模数转换器将图像模拟信息转换为能够被计算机读取和分析的离散数字值时使用的可能灰度值的二进制范围。例如，最常见的8位模数转换器的二进制范围为28即256个可能值，而10位转换器的二进制范围为210（1024个可能值），16位转换器的二进制范围为216（65536个可能值）。模数转换器的位深决定灰度增量的大小，更高的位深对应于从相机获得更大范围的有用图像信息。另一个重要概念，动态范围通常指除了相机噪声以外最大可获得的信号，其中信号由满井容量（每个像素能够容纳的最大光电子数）决定，噪声是暗噪声和读出噪声的总和。随着图像传感器动态范围的增加，定量测量最暗强度的能力也得到了提高。

一个具有4个系统噪声电子的检测器在每个灰度级至少使用4个电子，那么需要16384（4*212）个电子的输入范围才能将12位分辨率数字化。请注意，对于一些具有12位（4096灰度）、14位（16384灰度）或甚至16位（65536灰度）模数转换器的图像传感器（尤其是CCD），图像检测器材料可能没有足够的满井容量，无法在任何情况下满足整个模数转换器输入范围。在这种情况下，模数转换器产生的灰度比从探测器获得的实际光电子要多。这通常是商业化单色相机系统将图像数据数字化到10位以上遇到的情况。模数转换器具有高位深的重要性在于捕获信号强度（其实就是对比度）实际差异的能力，即使这样做会使传感器实际获得的灰度变小。

通过设置增益，补偿，放大器读出速度等参数，相机或PMT的信号可以与模数转换器的输入范围相匹配。例如，如果两个分别收集了101和109个电子的相邻像素元被送入一个输入范围为2560个电子的8位转换器中，则每个灰度级别需要10个电子。如果没有电子增益，相邻像素在最终图像中将具有相同的值（灰度级别为10）。如果这个系统的检测器噪声只有2个电子，那么101和109的计数应该是可分辨的。应用增益系数5（乘法处理）转换成505和545个电子，现在由模数转换器采样到的值为50和54。即增益放大器增加了检测器检测到的值的差异，使得模拟转换器现在可以将其转换成不同的值。在这个假设的情况下，增益系数5会将任何大于约500的检测值超出模数转换器输入范围，补偿系数可用于在数字化之前减去电子。在上面的例子中减去400个电子得到105和145个电子，在由模数转换器采样到的值为10和14。在实际中，增益放大器根据增益系数的比例引入噪声，限制了有效的增益倍数。

在实践中，应调整检测器和照明的光圈，从仍然包含特征识别和背景所需信息的尽可能小的样本区域收集光。对一个更大的面积成像增加了样品暴露在光照下的时间，并延长了传感器的读出时间。对于数码相机，可使用随附的采集软件设置读数区域。还应考虑物镜分辨率与图像传感器分辨率的匹配。激光扫描共聚焦显微镜也可以用软件选择图像采集区域，巧妙地伪装成缩放功能。使用此功能时，需要注意缩放系数与空间采样率之间的相互关系，这通常会由显微镜软件重新计算。如果在图像中选择一个小的区域并不能按比例改变样本（像素）的数量，那么缩短照明和读出时间的目标就没有实现。在这种情况下，应根据采样率重新设置图像大小，同时考虑物镜的分辨率限制。

对于高端成像的用户来说，简单的对相机分辨率的追求已经越来越边缘化，更多的开始关注一些以前没有被注意到但是其实对成像结果有很大影响的参数，比如动态范围，量子效率，满井容量，读出噪声等等。对一些动态事件的研究对于相机的传输速度也有越来越高的要求。这也是相机芯片技术的日新月异所带来的进步。

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