深度解读| 过表达OsHSP18.0-CI提高水稻对细菌性条斑病的抗性的研究

导读：热激蛋白（HSP）是生物体在高温、干旱、渗透胁迫等环境条件下诱导合成的一类应激蛋白，其中小分子热激蛋白在植物体内尤其丰富，能够参与生物和非生物胁迫应答过程。针对某个小分子热激蛋白在某种植物体内的功能研究，可以通过高通量测序的手段对野生型及实验植株进行差异表达分析，探索基因表达量的变化，进而验证一些猜想。而对于测序设备及试剂的选择，可以更加着眼于设备自身的通用程度，以及试剂盒支撑做生物学重复的适宜程度，进行综合评价。

文献名称：Overexpression of OsHSP18.0-CI Enhances Resistance toBacterial Leaf Streak in Rice

中文译名：过表达OsHSP18.0-CI 提高水稻对细菌性条斑病的抗性的研究

发表期刊：Rice

发表时间：04.17.2017

发表单位：山东农业大学

研究摘要

本文研究发现，当水稻受到Xanthomonas oryzae pv.oryzicola (Xoc)侵染，基因OsHSP18.0-CI 的表达量存在显著升高。转基因水稻中基因OsHSP18.0-CI 的超表达，能有效的提高水稻抗病能力，反之其抗性明显减弱。这证明该基因能够正向调控水稻抗细菌性条斑病。该研究采用BGISEQ-500测序平台对野生型和超表达植株在侵染前和侵染后差异表达的基因进行RNA-Seq检测并发现，许多基因在侵染后的表达量明显升高，尤其是在超表达植株中表现更为明显。

研究背景

小分子热激蛋白家族能够参与生物和非生物胁迫应答过程，家族中的OsHSP18.0-CI 基因参与了植物的盐胁迫应答，镉离子耐受和病毒RNA聚合酶互作。该基因在水稻生物胁迫中的功能一直有待研究。

研究方法及结果

qRT-PCR检测Xoc侵染前后水稻叶片中OsHSP18.0-CI 的表达情况。发现侵染后12h，基因OsHSP18.0-CI 的表达量明显升高，并在24h达到顶峰（图1）。

图 1. RS105侵染后0h,6h, 12h, 24h, 72h。基因OsHSP18.0-CI 在水稻Shengdao806中表达情况

通过转基因超表达基因OsHSP18.0-CI 也可以显著的提高水稻抗Xoc的能力（图2和图4）。而RNAi技术抑制基因OsHSP18.0-CI 表达则导致水稻抗性的明显减弱（图3和图4）。

图 2. 转基因和野生型的创伤长度比较(a)与基因OsHSP18.0-CI 的表达情况(b)

图 3. RNAi处理和野生型的创伤长度比较(a)与基因OsHSP18.0-CI 的表达情况(b)

图 4 野生型、转基因和RNAi处理的T2代的创伤长度比较

对超表达株OE(CD39R-7)和野生型WT分别进行Xoc侵染。采用BGISEQ-500测序平台的RNA-Seq测序和生物信息分析。平均每份RNA样本测序得到24M的clean reads。与参考基因组的比对率在87% 左右，平均检测到28872个基因有表达（表1）。根据参考基因在样本的RPKM值，寻找侵染前后（OE, WT, OE-24, WT-24）各样本的差异表达基因，并进行KOG, GO, KEGG, COG和差异基因聚类分析。

表 1 RNA-Seq数据结果统计

OE vs WT结果显示，有403个基因上调表达，72个基因下调表达。这些基因的功能大部分属于内源性刺激反应、信号转导、细胞过程、非生物和生物刺激应答等。WT-24 vs WT结果显示，有898个基因上调表达，128个基因下调表达。OE-24 vs OE结果显示，有1844个基因上调表达，154个基因下调表达。 这些差异表达的基因被分成40类。OE-24和WT-24上调表达的1844和898个基因中有738个基因是共有的（图. 5a），OE-24和WT-24下调表达的128和154个基因中有29个基因是共有的（图. 5b）对这738个和29个基因在不同样本的表达差异比较发现，694个和16个基因在OE-24中的表达差异高于WT-24（图. 5c）。

图 5. OE vs WT, WT-24 vs WT, andOE-24 vs OE上调和下调表达基因的统计韦恩图(a, b)；差异表达基因聚类热图

在738个和28个差异表达基因中发现13个PRs(病程相关基因)，8个水杨酸合成相关基因和7个茉莉酸合成相关基因。这些基因在OE-24中的差异都比WT-24要明显很多（图. 6a）。并且从OE和WT体内的SA和JA含量也能证明这一点（图. 6c, d）。选取10个差异表达基因进行qRT-PCR进行验证，其结果与RNA-Seq完全吻合（图. 6b）

图 6. (a)PR,SA和JA差异基因聚类热图；(b)10个PR基因的qRT-PCR验证结果；(c，d)OE和WT中SA和JA浓度比较

讨论

作者从单一基因功能研究入手，在做完转基因和RNAi实验之后，先用qRT-PCR对该基因的表达进行验证，在得到预期结果后，使用BGISEQ-500测序平台进行了RNA-Seq分析，clean reads比对率达到99.98%。RNA-Seq的结果不仅验证了qRT-PCR的结果，同时还得到了许多差异表达的基因，对这些差异基因做了进一步的生物信息学分析，并针对PR, SA和JA相关的基因做了进一步研究。最终通过侵染前后OsHSP18.0-CI基因差异表达结果，得出转基因水稻中基因OsHSP18.0-CI 的超表达，能有效的提高水稻抗病能力的结论。

BGISEQ-500测序平台RNA-Seq

基于BGISEQ-500测序平台的RNA-Seq，使用配套试剂盒将0.2-2.5 μg total RNA制备得到单链环状cDNA文库，结合转录组建库实验方法与数字基因表达谱的信息分析手段，确保在整体水平对基因表达量测定的准确性，同时优化单个样本的测序成本，更适合做生物学重复。

撰稿：史   磊

编辑：市场部

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