干货丨固相萃取常见问题解决方案大集锦

答：首先我们来看一下，检测的基本原理。

第一步：提取步骤

解析：

1.试样的提取，做加标回收率测试时，添加的应该是氯丙醇脂肪酸酯混合标准工作液，并加入氘代氯丙醇脂肪酸酯混合标准工作液。

2.使用4mL正己烷提取，超声20min，提取两次，合并正己烷相，N2吹到1mL

3. 对于乳粉和咖啡粉等固体粉末，需要加入2ml水，对于香肠等动物等动物性样品，使用乙腈饱和的正己烷提取。

4.为什么还要加D5-1，3DCP和D5-2，3-DCP；因为氘代氯丙醇脂肪酸酯中只有D5-3-MCPD棕榈酸单酯和D5-2-MCPD硬脂酸双酯，通过酯键断裂，变成了D5-3-MCP和D5-2-MCP，检测需要四种氘代氯丙醇内标，因而加了D5-1，3DCP和D5-2，3-DCP。

第二步：脂肪键断裂反应

解析：

1.碱脂解反应:氯丙醇脂肪酸酯在甲醇钠-甲醇溶液中酯解成脂肪酸和氯丙醇。

2.甲醇钠的浓度为0.5mol/L，研究表明，氯丙醇的响应随着甲醇钠的用量增大，先增加后降低，最佳用量为1mL，但是使用内标法，峰面积比值降低（As/Ai）一致，因此该方法需要使用内标法，另外内标法虽然响应降低一致，但是增大用量和浓度，可能导致其检测灵敏度降低。

3.室温反应4min，初始水解时间短，则可能水解不完全，随着时间长，水解完全，但是可能导致氯丙醇降解，导致检测灵敏度降低。

4.加入冰乙酸，中和碱，使得脂解反应终止。

5.加入氯化钠萃取时，为什么检测的是氯丙醇脂肪酸酯和缩水甘油酯的总含量，因为缩水甘油酯与氯离子共存，受热情况下可以转化为氯丙醇脂。

6.为什么用NaCl溶液或者NaBr溶液萃取，其实是降低氯丙醇的降解。

第三步：净化

解析:

1.硅藻土小柱的作用（固体支持液液萃取，SLE）

2.无水硫酸钠 （除水）

3.N2吹浓缩到0.5mL（不可吹干，氯丙醇沸点低）

第四步：衍生化

解析：

1.氯丙醇为什么不直接检测，而要衍生化呢，因为氯丙醇极性大。

2.测试时（若回收率低），则应当测试衍生化效率，包括七氟丁酰基咪唑的用量，反应最适温度，反应时间，找到实验最佳条件。

3.标准溶液配制标准曲线，加入氯丙醇混合工作溶液，加入内标，按照19.5操作。

答：我们来看一下SN/T 4519-2016标准中利巴韦林检测的前处理操作过程：

注：4.10的洗脱液如下：

我们看到：该标准通过三氯乙酸提取后，通过磷酸酯酶酶解后，使用氨水调节pH到8.5作为上样液，最终通过甲酸-水-甲醇溶液洗脱，有点类似于离子交换小柱的操作，我们来深扒一下，其背后的原理：

PBA苯硼酸小柱，为硅胶键合苯硼酸官能团，主要通过可逆的共价键的方式保留分析物，在碱性条件下，硼酸基团能与顺二羟基结构作用，生成稳定的五元环络合物，酸性条件下络合被打开。这一特性 赋予了硼酸类亲和色谱材料富集提取含有顺二羟基结构的各类生物分子的能力，其作用方式属于亲和色谱作用力一类。对于具有顺二羟基的化合物保留萃取特性良好，典型的具有顺二羟基的化合物如：

利巴韦林

去甲乌药碱

也就是说，对于有顺二羟基结构的化合物，都可以使用PBA小柱进行处理，比如：儿茶酚类、核酸类、一些蛋白质、碳水化合物和PEG 化合物、氨基酸、a-羟基酰胺类、酮类化合物也能得到保留等，都能在PBA上得到保留。

答：GCB（Graphitized Carbon Black，GCB），俗称：石墨化炭黑，它是将炭黑在惰性气氛下加热到2700-3000℃烘焙而成的，其具有六个碳原子构成的平面六角形，构成鳞片状结构，常用于去除色素，甾醇、苯酚、氯苯胺等，在使用过程中，在使用过程中经常会遇到小柱本底干扰的问题，那么怎么去解决呢？

我们通过测试，分别使用GC级别的甲苯，二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷10mL淋洗GCB小柱，收集过柱淋洗液，N2吹干，1mL丙酮复溶，上GC-ECD检测有机氯，图谱如下：

甲苯淋洗

二氯甲烷淋洗

乙酸乙酯淋洗  

丙酮淋洗   

正己烷淋洗 

 19种有机氯标液

从测试结果看，若不预处理GCB小柱而直接使用，会产生较大的小柱本底干扰的现象，那么有没有好的解决办法，在做实验前，消除小柱的本底干扰呢？为此，我们做了如下测试：

分别使用GC级别的甲苯，二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷10mL淋洗GCB小柱，抽干小柱，再使用 10mL乙酸乙酯：正己烷（1：1）洗脱，收集洗脱液，N2吹至近干，1mL丙酮溶解，得到如下谱图：

甲苯预处理  

二氯甲烷预处理

乙酸乙酯预处理

 丙酮预处理

正己烷预处理 

19种有机氯标液

我们发现，通过预处理的GCB小柱，比如使用甲苯、二氯甲烷溶剂淋洗后，GCB小柱带来的干扰有机氯检测的本底问题可以得到很好的解决，因此在实际使用过程中，我们遇到小柱本底问题，可以通过小柱的特性吸附原理，选择合适的试剂进行预处理，以达到消除小柱本底的问题困扰。