专题讲堂 | NGS靶向重测序，定将让您受益无穷！

第一篇

NGS靶向重测序

让您受益无穷

全基因组测序（WGS）成本的下降对科学而言是令人兴奋的进步，其他NGS方法（如靶向重测序）的成本下降和简单易行也让NGS的优势能够在科学界更大范围内普及。随着靶向重测序的发展和普及，这项技术已被证明是体细胞突变和胚系突变检测的一种强大工具。

靶向重测序是在测序前分离并富集一组基因或目标区域（测序panel），所以它能高效且经济地发挥NGS技术的优势。它实现了深度测序（以更高的覆盖度水平测序），在检出感兴趣的特定区域中的变异或低频率等位基因时，它比桑格测序的可信度更高。当速度成为实验成功的关键因素时，靶向重测序具有更短的周转时间，这是因为其多重检测的能力更高，数据分析的要求更低，且单个实验能够对成千上万个目标进行测序。

靶向重测序能够发现变异，比如低频率的变异，而这些变异利用PCR或桑格测序难以鉴定或成本太高。这种低频率变异检出的能力能够实现新的功能变异的鉴定，促进生物标志物的探索，或推动转化研究中临床相关目标的鉴定。对于复杂样本中体细胞突变的发现，如混有胚系突变的癌变肿瘤，靶向重测序也特别有用。无论是开展癌症研究、微生物基因组学、农业基因组学，还是分子流行病学，研究人员都能够靶定与他们感兴趣的特定基因组区域。

靶向重测序vs桑格测序的数据产出

靶向重测序在什么时候最有意义

随着技术变化的步伐加快，决定何时引入一项新技术，或是否从一种方法彻底转换到另一种方法，也是一件难以评估的事情。什么时候使用PCR、桑格测序、靶向重测序，抑或其他NGS方法，如外显子组测序或WGS，这个决定取决于多个因素。具体包括样本的数量、目标区域中序列的总量、预算上的考虑，以及研究的总体目标。当目标区域的数量较低（1-20个目标区域），或研究目标仅限于筛查或鉴定已知的目标或变异时，桑格测序和PCR通常是不错的选择。在测序范围的另一端，外显子组测序和WGS是全面的遗传分析和变异探索的极佳选择。靶向重测序则成为两者之间的折中之选，既支持筛查，又支持变异探索研究。在对大量样本的成千上万个基因进行测序时，它是最具成本效益的一种方法。与传统的反复测序相比，靶向重测序能够同时对多个样本中的多个基因进行测序，节省时间和资源。此外，靶向重测序方法只需要较少的DNA，从而节省了宝贵的样本材料，在分析法医DNA样本或肿瘤液体活检样本时，这也是需要重点考虑一个方面。

不同技术的适用范围

靶向重测序可以做深度测序，同时灵敏度更高

靶向重测序是替代单基因检测的一种快速而经济的方法。不过，靶向重测序的最强之处在于能够以比WGS或桑格测序高得多的覆盖水平对感兴趣的特定区域进行测序。WGS的覆盖度通常是30-75倍，而靶向重测序可实现5000倍甚至更高的测序深度。从研究的角度来看，深度测序意味着更高的灵敏度（能够检测低频率的变异）。桑格测序的检测极限为15%的等位基因频率，而NGS靶向重测序的检测极限低至1%。深度测序以及随之而来的高灵敏度对某些研究而言是至关重要的，比如检测异质性肿瘤中低频率的亚克隆或检测体细胞嵌合突变。一些研究已经表明，桑格测序的灵敏度达不到稳定检测嵌合突变所需的灵敏度。GlobalGene 公司的联合创始人SaumyaJamuar 博士曾在MiSeq系统上使用TruSeqCustom Amplicon Library Prep Kit，以鉴定那些导致神经系统畸形的稀有嵌合突变。Jamuar 博士评价了靶向重测序和桑格测序在体细胞变异检测上的表现：

靶向重测序让临床研究周转更快

对临床或转化研究而言，检测不仅要准确，还要快速并且经济。检测必须是准确的，因为它们将用于疾病诊断、风险分层和药物治疗。评估转化研究的临床样本时，速度也是一个关键因素。尽管桑格测序多年来一直被认为是临床研究的金标准，但若要检测多个基因和多个样本时，桑格测序不但耗时，效率也很低。此外，组织材料有限时几乎无法实现多次桑格基因检测。靶向重测序在临床和转化研究人员中正日渐流行，因为它高效地解决了许多挑战。德国科隆大学医院的一项研究将桑格测序与靶向重测序方法进行比较，发现靶向重测序的多重检测能力缩短了肿瘤样本分析的周转时间。此外，研究作者还发现，与桑格测序相比，靶向重测序所需的起始材料明显要少得多，被证明是一种更具成本效益的方法。

一位研究癫痫的研究人员需要检测10个样本中的3个基因，总共有94个可能的变异（ATP1A2 = 34个目标，ATP13A2 = 47个目标，以及CDKL5=13个目标）。以每个变异1次反应来计算，桑格测序总共需要20块反应板（10个样本 x 1块板 x 2个反应（正向和反向）= 20 x 96孔板）。假设1名全职员工每天制备4块板，桑格测序将需要5天。相比之下，利用靶向重测序和样本多重检测（用TruSeq Custom Amplicon Library Prep Kit制备文库，并在MiniSeq™系统上测序），相同的研究可在1.5天内完成。与其他技术相比，多重检测（在单个测序运行中合并多个样本）以及同时测序数千个目标的能力让周转时间更短。

Robarts研究所Blackburn心血管遗传学实验室的研究主任JohnRobinson博士曾在MiSeq®系统上使用定制的靶向重测序集合（Nextera®Rapid Capture Enrichment），以分析与血脂异常及相关的代谢疾病有关的遗传变异。Robinson博士分享了用靶向重测序和桑格测序在鉴定与脂代谢相关变异时的体会：

靶向重测序具备更强的检测能力和最高的突变分辨率

尽管PCR和桑格测序提供了为人熟知的快速流程，但靶向重测序具有更强的检测能力（鉴定全新变异体）、变异分辨率高（单碱基分辨率）。PCR、桑格测序和靶向重测序提供了不同水平的信息，这取决于不同的研究目标。PCR可指示变异是否存在，但不能提供单碱基的分辨率。桑格测序能够经济地鉴定特定的变异，达到单碱基分辨率，适合少数基因或目标区域。与qPCR和桑格测序不同，靶向重测序能够在单个实验中鉴定数千个目标区域中的变异，达到单碱基分辨率。此外，由于序列检测的范围更广以及靶向的序列捕获方法，检测新变异的可能性要高得多。

随着现成的预设计靶向重测序Panel、简单的在线定制设计工具，以及桌面式NGS测序仪的出现，靶向重测序正变得比以往更加简单、更加普及。靶向重测序的总成本在继续下降，而简易的生物信息学解决方案也在减轻以往NGS数据分析的挑战。目前市场上有多种类型的文库制备试剂盒，它们适用于靶向重测序，扩大了科学家和研究人员的选择范围。这包括含有预选靶标的各种Panel，以及通过在线方法定制感兴趣的特定区域，适用于设计和订购定制测序Panel。与PCR和桑格测序相比，NGS靶向重测序有明显的优势，所以越来越多的生物学家和转化研究人员在其变异检测研究中选择了它。

PCR、桑格测序和靶向重测序比较表