HM4 不期而来：抗体 IgM & IgG 必备分析方案！

2020-12-16 11:53:12, 华质君华质泰科生物技术（北京）有限公司

针对新冠，目前的检测方法主要集中在核酸检测和抗体检测。二者各有千秋，无所谓孰优孰劣，都存在一定比例的假阴性或假阳性。核酸检测在病毒感染两天后即可开始实施，约三周内 (病毒 RNA 及抗原存留约25天) 均可由实时 RT-PCR 技术检出阳性。

抗体是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白，存于血清、体液、外分泌液和细胞膜，大致分五类，临床上常检测 IgA、IgG、IgM 三项。目前新冠抗体检测试剂主要针对总抗体、IgM 抗体和 IgG 抗体的检测。

Courtesy of Dr LIU at tCDC

新冠病毒感染一周后始现 IgM 抗体，其检测窗口期约一周 (10-18天内可检出阳性)；自第二周开始病人产生 IgG 抗体，其检测窗口稍宽约四周 (15-45天内)。因此，IgM 抗体增高提示近期感染，IgG 抗体增高则提示既往感染，未知仍否具传染性。

核酸检测属常规方法，而最近的病毒溯源努力促使多国加大了抗体检测力度，除筛查感染者外，另一目的是确定已具免疫力的人群，是追踪疫情爆发轨迹的重要手段，也为未来的疫情防控“退出”战略做准备。

蛋白质和抗体属生物大分子。2002年，John Fenn 和田中耕一获得诺贝尔化学奖，他们发展的大气压离子化技术（电喷雾 ESI 和基质辅助激光解离 MALDI）使得质谱技术直接测定生物大分子成为可能。瑞士 CovalX 公司推出的 HM4“超”大分子检测系统，扩展 MALDI 质谱的检测上限达250万Da ，为百万级分子量的生物大分子直接检测，提出了新型方案。

抗体检测

HM4型检测器，扩展 MALDI 质谱检测上限达250万Da。

完整病毒衣壳，浓度8.5μM，TERN-1⁺ 的分子量（质荷比）约为201万 Da。

IgG 单克隆抗体10μM，同等条件，标准 MCP 检测器（蓝色），仅检测到单聚体14.5万 Da 分子量；HM4检测器（红色），双聚体、甚至三聚体44.3万 Da 分子量轻松检到。

两个抗体样品（A: IgG 4.5μM，B: IgM 0.3μM），在标准检测器（红色）和 HM4检测器（蓝色）之间以无线控制器切换，同等实验条件下的结果对比：HM4既保证了超大分子（如 IgG 四聚体和 IgM 单聚体）的分析灵敏度，又避免了高丰度离子信号的饱和，真实地反映了抗体含量。

02	抗体聚集体分析

在治疗性抗体和生物仿制药的开发和生产过程中，抗体聚集和降解会导致严重后果，如免疫应激和功效降低。当前用于分析抗体聚集的方法比如分子排阻色谱（SEC）等都有一定的局限性。食药管理局（FDA）等监管机构要求补充聚集体等数据。

HM4检测器（CovalX）结合 AXIMA MALDI-TOF MS（Shimadzu）；HM4和标准检测器切换示意图。

使用 CovalX K200型交联试剂形成稳定的蛋白聚集体，用于超高分子量 MALDI 质谱分析。

使用 HM4-AXIMA MegaTOF 检测到分子量超110万 Da 的 IgM。

HM MALDI-TOF 检测色谱分离出的蛋白聚集体。其中许多高聚集体洗脱出蓝色馏分，三聚体，四聚体和五聚体洗脱出红色馏分，绿色馏分为二聚体，及黄色部分为单体。

使用 CovalX 化学交联试剂稳定样品后，对抗体聚集体进行 HM MALDI-TOF MS 分析，能有效检测到高达150万 Da 的离子信号，为有效测量可溶性低阶聚集体提供了新方案。

03	构象表位作图/抗原表位表征

An anti-Gn glycoprotein antibody from a convalescent patient potently inhibits the infection of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus

康复期患者体内提取的抗 Gn 糖蛋白抗体可有效抑制发热伴血小板减少症病毒的感染

Ki Hyun KimI, Jinhee Kim , Meehyun Ko , June Young ChunI, Hyori Kim , Seungtaek KimI, Ji-Young Min , Wan Beom Park , Myoung-don OhI, Junho ChungI

PLOS Pathogens, February, 2019

https://doi.org/10.1371/journal. ppat.1007375

发热伴血小板减少综合征（SFTS），是种新发传染病，其性征是严重出血和高致死率，尚无针对该疾病的特定疫苗或治疗措施。SFTS 的病原体为 SFTS 病毒（SFTSV），自2010年首次报道以来，在中国、日本、韩国、美国等地区都有出现。为开发治疗 SFTS 的药物，韩国首尔国立大学医学院 Junho Chung 课题组从康复病人体内提取针对 Gn 和 Gc 糖蛋白的抗体，构建抗体库，发现一种被命名为 Ab10的 Gn 抗体，在体外和动物研究中均能有效抑制 SFTS 病毒感染。

研究中使用 CovalX 公司的交联试剂，和配有 HM4检测器的 MALDI TOF/TOF 对 Ab10的构象表征进行分析。

基于其表位，研究人员推断 Ab10可与目前报道的大多数 SFTSV 分离物相互作用，有望被开发成针对多种 SFTS 病毒的治疗方法。文章于2019年发表在《Plos PATHOGENS》期刊。

通过丙氨酸突变试验确定 Ab10的构象表位。（A）红色表示通过交联剂辅助质谱预测的 Ab10表位，紫色表示影响 Ab10抗体结合的丙氨酸取代的残基。（B）Ab10对每个丙氨酸突变体的相对结合活性。

HM4“超”大分子质谱检测器

HM4“超”大分子 MALDI TOF MS 检测器基于独特的转换打拿极技术，扩展质谱检测质量上限到达250万 Da，实现 nM 浓度的超痕量、大分子抗体药物和蛋白质复合物的高灵敏度分析。在诸如蛋白质复合物测定、蛋白质相互作用、抗原抗体检测、蛋白质聚集分析、超大分子质谱成像、临床转化医学、生物制药等领域的应用卓尔不群！

传统的电喷雾 ESI-MS 质谱对于生物大分子的检测，除需耗时的色谱分离外，对获得的多电荷谱图进行去卷积也使数据分析异常繁琐。HM4“超”大分子检测系统，可对超高分子量蛋白复合物或聚集体的检测提供简便、直观、超敏的单电荷数据。

只需稍加改造，HM4与 MALDI-TOFMS 质谱仪的原有检测器兼容，轻松切换，互不干扰。操作者能直观比较两种检测器对超大分子分析检测显著的结果和性能差异。