干货丨从质谱研究病毒复制说起：稳定的负离子模式 TVNM

2020-12-16 11:53:12 华质泰科生物技术（北京）有限公司

多数时候，人类在历史上对传染疾病的胜利，都是靠自身免疫系统对病毒的抵御并自愈。

目前为止，没有有效药物能直接杀死病毒（任何文章只要号称是直接杀死病毒的特效药都可以打入冷宫），防为主治为辅。对未感染的人群：1、疫苗激活人体免疫能力，提前对病毒产生抗体；2、隔离、物理防护、消毒等方式阻止疫情蔓延。对已感染的人群：1、抑制类抗病毒药物阻断病毒复制；2、激素类药物或其它方式激活人体免疫系统，正面与病毒作战。

1918 年爆发的西班牙流感，则没有这样全面的医疗系统来应对，对已感染的人只能任凭其发展，唐顿庄园里这款烈性传染病就短时间致死大表哥马修的前未婚妻。在第二波感染的记录中，很多人早上染病，从症状开始到死亡不足 12 个小时，有的人上了公交车，直接就在公交车上毙命。

幸运的是，到 1920 年 12 月，历时 3 年的病毒大屠杀终于撤退。

回看历史，总是希望能够明智。

目前肆虐在全球的新型冠状病毒和 HIV-1 即人类免疫缺陷病毒1型（俗称艾滋病毒）一样，都是一种 RNA 病毒。病毒靠自我复制，实现体内增值。复制过程中的一个关键步骤就是 RNA 需要和核衣壳的 Gagpolyprotein 结合，这种结合是非共价的。HIV-1 RNA 有 SL1-SL4 保守区域，可以和 Gag 结合。如果药物（inhibitor）能和 SL1，SL2，SL3，SL4 结合，就有可能抑制 RNA 和 Gag 的结合，从而抑制病毒复制。

通常的纳升级电喷雾 nESI 负离子模式很不稳定，而 RNA 是带负电荷的，必须使用负离子模式。于是研究提出：利用自动化的芯片多通道纳喷（TriVersa NanoMate，TVNM）质谱技术在负离子模式下研究 RNA 和一些可能的小分子药物的非共价作用。TVNM 负离子模式是很稳定的，在研究非共价相互作用方面有成功的应用，以期该方案对加速开发抑制病毒疫情的大小分子药物，有启发和借鉴意义。同时，TVNM 在研究非共价相互作用方面表现出色，也是天然蛋白质的研究和促进生物抗体药物发现的解决方案。

非共价健相互作用 Noncovalent Interactions

Studying RNA-Small Molecule Binding Using Automated Chip-based Nanoelectrospray Mass Spectrometry in Negative Ion Mode

利用自动化的芯片多通道纳喷（TVNM）质谱技术在负离子模式下研究 RNA-小分子结合

前言：纳升电喷雾电离质谱（nESI-MS）不仅是确定一级蛋白质结构和表征的重要工具，更是筛选和研究非共价蛋白质/ DNA / RNA-配体相互作用的特定方法 (Bovet et al. 2007)。与水基研究相比，基于 MS 的非共价相互作用研究具有一系列优势，如，不使用放射性标记物、分析速度更快、灵敏度更高、获得的信息更翔实、和能利用巨大的配体库搜索。

负离子模式 nESI-MS 极具挑战性，在蛋白质与配体相互作用普遍发生在高水相的生理条件下，负模式纳喷尤其困难。这里我们展示了利用负离子模式下的芯片多通道纳喷质谱研究 Ψ-RNA 与小分子抑制剂之间非共价相互作用方面的成功应用。

应用：人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1 俗称艾滋病毒）的复制周期包括病毒 RNA 与 Gagpolyprotein 核衣壳结构域相互作用的关键步骤。该 RNA 结合区称为 Ψ-RNA，是高度保守的，该区域折叠成四个稳定的茎环（SL1 至 SL4），它们是 Gag 的结合面。因此，SL1 至 SL4 是令人关注的药物靶点。用小分子抑制剂阻断这些结合位点将阻止 Gag 结合进而可能阻止病毒复制 (Turner et al. 2006)。本方案展示了使用 TVNM（TriVersa NanoMate 芯片多通道纳喷源）在负离子模式下研究小分子抑制剂与 Ψ-RNA 之间的非共价相互作用方面的潜力。

TVNM 负离子模式下稳定的芯片纳喷信号，图中右上角插页显示了相同时间段传统的拉制毛细管纳喷（噪音多）总离子流图，用以比较说明不同的稳定性。

非共相互作用研究的 TriVersa NanoMate 的参数设定：

(e.g. QTof micro MS with 30-40 V cone voltage and 45-100ºC source temperature)

结果分析

图1. 仅 3.5 µM RNA-SL4 的 10min 的平均质谱数据，分子量 MW=6476.9（插图显示 MaxEnt1 解卷积分子量 MW=6476）

RNA SL4 在 m/z 1000-1800 之间显示出强大的电荷分布，其中最高信号出现在 m/z 1300 处的负五价电荷态。

图2. 将 3.5 µM RNA-SL4 与 5 µM 妥布霉素（分子量 Mw = 467.5，蓝色）和 0.5 µM 新霉素 B（分子量 Mw = 614.6，绿色）一起孵化。（插图显示了 MaxEnt1 解卷积分子量）。

配体筛选显示新霉素 B 和妥布霉素均与 RNA 结合，质量变化与计算值一致（理论分子量 6476.9）。

图3. 利用不断增加浓度的新霉素 B 滴定 3.5 µM RNA-SL4（黑色 0.1 µM < 10％结合，蓝色 0.5 µM > 90％结合）。

Kd 预估值为 2 µM (文献值 1.0 ± 0.2 [Turner et al. 2006]

总结：结果表明，芯片多通道纳喷 TVNM 可在负离子模式下自动筛选 Ψ-RNA-小分子非共相互作用。该纳喷系统实现了全自动化的无人值守操作，将用以进一步深入研究 RNA 配体相互作用、配体库筛和/或气相 Kd 值的计算。

参考文献：

Application of the Exactive Plus EMR for automated protein–ligand screening by non-covalent mass spectrometry

扩展质量范围的 Exactive Plus EMR 型号高分辨质谱结合芯片多通道纳喷在非共价相互作用质谱法对蛋白质-配体自动筛选中的应用

Hannah J. Maple, Olaf Scheibner, Mark Baumert, Mark Allen, Richard J. Taylor, Rachel A. Garlish, Maciej Bromirski and Rebecca J. Burnley

Rapid Commun. Mass Spectrom. 2014, 28, 1561–1568

原理：非共价相互作用质谱法在药物发现课题领域为蛋白质配体筛选提供了相当大的潜力。然而，通常采用的飞行时间 (TOF) 质谱仪有一些技术瓶颈，限制了非共价质谱在药物工业实验室中的应用。

方法：采用 Exactive Plus EMR (Thermo) 质谱仪对蛋白-小分子非共价相互作用进行表征。纳喷电离 (Chip-based nESI) 由芯片多通道纳喷源 TriVersa NanoMate (Advion) 实现。轨道阱 Orbitrap 质谱的离子传输多级杆、传输电压、透镜电压，裂解能量和碰撞气体压力都进行了优化。蛋白质鸟枪法纳喷注射分析，以配体滴定法来判断蛋白质-配体相互作用的保留程度，对天然蛋白质的系列稀释液测定灵敏度和检测下限，对异质蛋白质进行分析确定质谱分辨率。

结果：TVNM-EMR 良好保留了天然蛋白与配体间的相互作用，亲和力测定值与预期值吻合良好。质谱的高分辨率允许加合离子和分子离子的基线分离，提高配体互作的检测准确性和灵敏度（检出限）。数据也显示了高度糖基化蛋白质的多种糖型的基线分离。

结论：与 TVNM-TOF 质谱相比，芯片多通道纳喷-轨道阱质谱 (TVNM-Orbitrap) 组合技术具有显著的灵敏度和分辨率优势，提供了突破通量、数据分析快速、灵敏度成数倍提升、和样品需求量少的优势解决方案。高分辨率的另一个好处是使用非均质蛋白质样本（如糖蛋白）进行片段筛选的能力大大提升，扩大非共质谱法在制药和其他行业的适用范围。

(a) 39 nM 溶菌酶的 TVNM-Exactive Plus EMR 谱图 (30 秒，平均 20 微扫描);

(b) 625 nM 溶菌酶的 TVNM-Exactive Plus EMR 谱图 (<1 s，平均 20 微扫描，自动背景减法);

Sensitive identification, characterization, and quantification of intact proteins

完整蛋白的特异性识别、表征和定量

促进生物制药和生物研究

变性蛋白通常使用液质（LC-MS）分析，但许多生物制药和生物学研究需分析完整蛋白。Exactive Plus EMR 质谱仪将超高分辨率的 Orbitrap 技术与扩展质量范围（EMR）功能相结合，配以芯片多通道纳喷源（TriVersa NanoMate）用于研究三级和四级蛋白的组成及內部结构。常见的靶标物包括单克隆抗体中的杂质、抗体-药物偶联物（ADC）、蛋白寡聚体药物、糖型和蛋白组装。