成像专题丨分辨率和灵敏度可以兼得吗？

2020-12-16 11:55:13, 华质君华质泰科生物技术（北京）有限公司

1、何为质谱成像？

成像质谱（IMS）为非常灵敏的分子成像技术，提供分子及其空间分辨信息。分析对象可以是组织切片、物质表面、单细胞等，能同时在一次实验中可视化数千个不同分子的分布信息。为多分子同时成像技术。适于内源性化合物如脂质、肽和蛋白质，及外源性化合物如聚合物、药物的分布研究，提供从细胞到有机体的详细的生物过程分子信息。

2、质谱成像需要考虑哪些因素？

选择成像技术需要考虑至少七大要素：（a）空间分辨率（采样点之间的距离）；（b）靶点浓度或采样灵敏度（采样斑点的大小）；（c）离子化方式（纳喷最灵敏、其次 MALDI、再次 DESI）；（d）优化便捷性（高度自动化与否、是否需要基质、基质是否能喷匀、无需基质最好）；（e）组织切片或样品形状的兼容性（MALDI 及 DESI 空间受限，flowprobe 及 LESA 非常灵活兼容、是否保障样品生鲜态）；（f）温度可控性以避免组织分解（LESA 唯一可控温）；（g）数据转换和图像处理（3D 最佳）。

3、分辨率和灵敏度可以兼得吗？

空间分辨率和灵敏度就是“鱼和熊掌不可兼得”的关系！空间分辨率太高，有限靶点内的分子数目很少，对后端质谱的灵敏度要求就非常地高。受制于目前市场上质谱技术的灵敏度限制，业界普遍认为有实用价值的成像空间分辨率是 10~30 微米。再小些的分辨率几无合适的质谱仪能匹配；大一点儿的分辨率能联用的质谱仪会很多，灵敏度不成问题。空间分辨率如超过 300 微米，通常归类为轮廓（Profiling）分析（不应再称为成像 Imaging），用于如药物的组织间或组织内分布，或材料表面轮廓分析。

AP/MALDI 大气压基质辅助激光解吸源

4、目前质谱成像技术有哪些？

1）动植物成像，AP/MALDI UHR 或 MALDI 为成像优先选型，可达 5 μm 微米空间分辨率，最好配置 3D 成像软件。需要事先均匀地喷涂或制备基质。

AP/MALDI 的优点（相较于真空 MALDI）是常压操作，兼容各类基质包括挥发性基质、保持生理样品的原生态特征。固态激光的寿命非常长（近五年不用换），调谐非常简便，精巧好用。后端可兼容各类好质谱（QQQ、QTRAP、QTOF、Orbi、FTMS 等，当然选择 QTOF 的好处是分子量上限几无限制，其他类质谱有限制）。多数真空 MALDI 只能接 TOF 或 TOF-TOF。

2）DESI 需要溶剂，非无损技术，无需基质，适用于小分子、次生代谢物、脂质、多肽等分子成像。调谐和优化较难，需要专业背景知识，空间分辨率通常到 30-50 μm 微米；同样，后端可接各类好质谱（QQQ、QTRAP、QTOF、Orbi、FTMS 等），后续只能联接 Waters 品牌质谱仪。

3）AP/MALDI HR 型号可达 30 μm 微米空间分辨，是 UHR 的姊妹型号。多数用于分子量测定。

4）LESA 液滴萃取表面分析，为静态微萃取纳喷成像技术，灵敏度远高于 DESI，也高于 flowprobe，为全自动化机器人成像装置。空间分辨率一般，为 0.4-0.6 mm。此设备对代谢组学、脂质组学、蛋白质组学、微生物组学、抗体分析尤其是热门的抗体药物偶联物（ADCs）、非共作用（Non-Covalent Interactions）、药物分布分析、次生代谢分析等等都有广泛成熟的应用。是 Nature 杂志 2017 年推荐的组学流技术（文献可索取），无需基质，后端可自由选择各类高分辨或定量质谱（QQQ、QTRAP、QTOF、Orbi、FTMS 等，选择 QTOF 类的好处，是分子量范围几乎无限）。

液滴萃取表面分析–质谱系统（LESA-MS）

5）flowprobe，一种实时的动态微萃取成像技术，是美国橡树岭国家实验室的 Gary Van Berkel、及加拿大的 Tom Covey 博士等发明了静态液滴萃取表面分析（LESA）之后的又一创新发明，适用于细胞、组织、聚合物等平面类样品的药物分布研究、癌症分析、微生物聚类分析等方面。可看做为 DESI 升级版，灵敏度比 DESI 高 10-100 倍。若只论成像，flowprobe 分辨率差一些，为 0.6 mm，即几百 μm微米；基本和 LESA 及 DART 处于成像分辨率的第三梯队。但灵敏度远好于 DESI。

6）DART 为有机分子（分子量 5000 amu 以下）和部分金属有机物最佳的轮廓分析技术，广谱无歧视（甚至非极性组分亦能离子化），只是多肽和蛋白质难以分析。未达到成像级别，可称为轮廓分析（Profiling，法检材料物证分析的用途最广），空间分辨率最高只能到 0.4 mm。优点是非常皮实、快和高通量，最值得质谱人拥有，作为提高质谱潜能的工具。成像轮廓分析只是其一个小细分应用，DART 其他方面应用非常广泛。

DART 轮廓分析

5、质谱成像常被提及的技术参数是什么？它们之间有什么关系？

质谱成像有两个常被提及的技术指标：空间分辨率和灵敏度。空间分辨率是成像像素的尺寸，分辨率越高，像素尺寸越小，成像质量越细腻；灵敏度与空间分辨率是负相关。

这两个指标，需要再次指出，如同鱼和熊掌，不可兼得。提高分辨率必然降低灵敏度，反之亦然。

6、质谱成像技术，应如何选择？

几种技术各有长处和特色，可按具体的需求选择：

空间分辨率	AP/MALDI（5-30 微米）> DESI（20-50 微米）> LESA 或 flowprobe（0.4 毫米）
灵敏度	LESA > flowprobe > AP/MALDI > DESI
操作难度	DESI（最难）> flowprobe（稍容易）> AP/MALDI（简便）> LESA （最容易）
适合样品	LESA 或 flowprobe：2-5 厘米的较大的平面类样品（动植物切片、材料等）
	AP/MALDI 和 DESI：3-10 毫米的组织切片等
检测对象	LESA 或 flowprobe：有机小分子和生物大分子（包括多肽、蛋白质）均可；
	AP/MALDI：小分子如药物、代谢物、脂质等；大分子如多肽等；蛋白质较难。
	DESI：有机小分子和多肽。蛋白质很难。

flowprobe 动态微萃取

7、想要做质谱成像，需要哪些配套设备？

如果是 MALDI 或 AP/MALDI，还需要切片机、导电玻片和基质喷涂仪。切片机用来把组织样品做成 10-20 微米的切片；导电玻片不同于普通的载玻片，上面镀有一层氧化铟锡（Indium-Tin Oxide，ITO），具备导电性能，专用于 MALDI 成像；基质喷涂仪用来在切片表面均匀地喷覆基质，基质在切片上分布的均匀度、结晶的尺寸会影响成像的质量。

如果是 DESI、LESA 或 flowprobe，只需要切片机，这几种技术不需要基质，省却相关操作。

8、是否需要专门的成像软件？如何获得？

是的，需要专用的成像软件把采集的数据处理成图像。常规 MALDI 的成像软件一般由质谱厂家提供；AP/MALDI 和 LESA、flowprobe 目前使用的是开源的免费软件，如 BioMap、MSiReader 等。3D 成像软件较为新颖先进，可联系厂家购买正版或申请短期试用版。

9、能否重点详细比较一下 AP/MALDI 和 DESI ？

两者的原理不同：AP/MALDI 是通过基质化合物传递激光的能量，将目标分子离子化；DESI 是通过溶剂滚动萃取，后续通过类似于电喷雾的机制将目标分子离子化。

1）分辨率，AP/MALDI 可到 5 微米，优于 DESI 的 20-50 微米。

2）检测对象，AP/MALDI 既可以成像有机小分子，也可以成像多肽等生物大分子；DESI 更适合有机小分子，多肽已经较难。

3）两者都需要配套设备，除共同需要的切片机，AP/MALDI 还需要导电玻片和基质喷涂仪；DESI 无其他需求。

4）能联接的质谱，AP/MALDI 可与 Thermo、SCIEX、Agilent 和 Bruker 的常见轨道阱、离子阱、QTOF、QQQ 等联接；DESI 后续只能联接 Waters 品牌质谱仪。