相爱相杀——磷酸化组学揭示PIKK在遗传毒性胁迫下的分工合作

2020-12-01 13:39:04, 景杰学术杭州景杰生物科技股份有限公司

景杰学术| 报道

题目：Phosphoproteomics reveals novel modes of function and inter-relationships among PIKKs in response to genotoxic stress

发表时间：2020年11月20日

期刊：The EMBO Journal

影响因子：9.889

作者及单位：来自以色列、瑞士和奥地利的研究者们

主要结论：创建了一个更完整且具价值的DRR候选因子库，同时发现三个PIKK在DNA双链断裂过程中的分工与协作模式。

关键词：DNA损伤；磷脂酰肌醇3-激酶；磷酸化修饰组学

生物体细胞基因组完整性受到诸多因素的威胁，包括DNA复制过程中碱基错配、化学物质产生的交叉链（cross-links）、电离辐射诱导的DNA单链或者双链断裂等。其中，DNA双链断裂被认为是细胞毒性最强的DNA损伤。而在面对外界的各种威胁时，细胞也进化出复杂精密的DNA损伤修复途径来维持其基因组信息完整性，即 DNA损伤反应（DNA damage response, DDR）。

目前已知在DDR复杂网络首先由三个磷脂酰肌醇3-激酶相关蛋白激酶家族（PIKKs）成员—共济失调毛细管扩张突变基因（ataxia-telangiectasia mutated, ATM）、DNA依赖型蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase, DNA-PK）、ATR (ATM and RAD3-related）识别DNA损伤，再通过延缓或者阻滞细胞周期以保证细胞有足够时间进行DNA损伤修复，并启动信号级联促进DNA修复。尽管当前对于三个PIKK成员的研究已经获得了一些进展，例如很多肿瘤的潜在治疗药物即PIKK抑制剂、ATM在DNA双链断裂中发挥最主导的传感器作用等，但是，在遗传毒性胁迫的环境下，三个PIKK成员如何进行人分工合作去共同完成响应，却仍然有待探索。

文献速读

近日，来自以色列、瑞士和奥地利的研究者们在国际著名学术期刊The EMBO Journal上发表重要研究，对人野生型和A-T细胞（ATM缺失）进行DNA双链断裂诱导剂—新制癌菌素（neocarzinostatin, NCS）处理并进行全面的磷酸化修饰组学研究，同时利用靶向蛋白质组学SRM技术对于鉴定结果进行最终验证。作者不仅通过和一些过往研究结果进行对比，发现了一些新的DNA损伤反应参与因子，创建了一个更完整有价值的DRR候选因子库。同时发现三个PIKK在DNA双链断裂过程中的分工与协作模式，例如在A-T细胞中，ATR和DNA-PK可以一定程度上补偿ATM的缺失所带来的影响。

1、DNA双链断裂响应过程中的磷酸化修饰监测

作者首先分别对来源于健康人和A-T患者的淋巴母细胞（样本策略）进行NCS药物（放射模拟）处理，并在处理时选择行加入了ATM、DNA-PK和ATR 抑制剂。NCS处理20、60和240 min后分别收样，进行磷酸化修饰组学检测（质谱策略）。作者共鉴定到来源于2,818个蛋白的9,690个磷酸化肽段，其中有超过1,000个位点在至少某一时间点出现修饰有无的变化。GO分析显示，对NCS做出响应的磷酸化蛋白主要定位在细胞核中，并参与DNA损伤和mRNA处理等关键生物学过程（图1）。为了鉴定出除PIKK家族之外的一些参与到DNA双链断裂响应过程中的激酶，作者进行了细致的motif分析，并且将自己的结果与过往34项相关报道进行整合对比，建立了一个更新更完整的资源库。

图1 DNA双链断裂响应过程中的磷酸化修饰监测

2、PIKK在DNA损伤反应中的高度参与性

为了更好的解释不同PIKK在DNA损伤反应中的作用模式，作者利用三种不同的PIKK抑制剂（分别为ATM、DNA-PK和ATR 抑制剂）对野生型细胞进行处理。作者发现，PIKK负责了基本70%的NCS响应调控过程，而且其中大多数是ATM依赖性的。除此之外，在NCS引起的磷酸化过程中，有一些磷酸化位点和蛋白是受到不止一个PIKK调控的（图2a-b）。以往报道证明ATM是DNA双链断裂响应的最主要传感器，而ATR则主要负责调控复制压力响应。因此作者除NCS处理之外，也进行了HU处理来诱导复制压力，观测PIKK之间的作用模式。有趣的是，作者发现在NCS处理20min后ATM依赖的磷酸化位点会以ATR依赖的磷酸化响应HU处理，而如ATM依赖性的pT68/CHK2位点（典型的DNA双链断裂响应位点）在HU处理仍然是ATM依赖性的。

图2 PIKK在DNA损伤反应中的高度参与性

3、PIKK之间的 “相爱相杀”

作者观测到NCS诱导的磷酸化反应中出现了一个特殊的群体：在NCS处理4小时后，它们的磷酸化水平会在DNA-PK抑制剂处理的WT细胞中（相对于未经过此抑制剂处理组）进一步升高。而且这种现象仅出现在WT组别，并没有在A-T细胞中观察到，表明它代表ATM依赖性磷酸化现象。通过后续分析，作者认为DNA-PK可能负向调控ATM或者正向调控一些ATM对抗作用的因子，而DNA-PK抑制剂加入也许通过更多的DNA双链断裂的堆积激活了ATM通路。除明显的对抗作用外，更有意思的是，作者发现在ATM缺失的A-T细胞中，DNA-PK和ATR可以一定程度上弥补其缺失所导致的影响，例如有55个ATM依赖性的特异性磷酸化位点会在A-T组别中呈现DNA-PK或者ATR依赖。这种弥补现象，在加入了ATM抑制剂的野生型细胞中也得到了证实（图3）。

图3 PIKK之间的分工与合作

最后，作者还利用了靶向蛋白质组学的方法（SRM）对部分关键的磷酸化蛋白和位点进行了验证，再次证实了前期修饰组学结果的可靠性和可重复性。

小结与展望

本文通过对人野生型和A-T细胞（ATM缺失）进行DNA双链断裂诱导剂—新制癌菌素（NCS）处理并进行全面的磷酸化修饰组学研究，不仅发现了一些新的DNA损伤反应参与因子，创建了一个更完整有价值的DRR候选因子库。同时发现三个PIKK（ATM、DNA-PK和ATR）在DNA双链断裂过程中以及复制压力响应中的重要参与作用。三者之间存在一定的干扰和不可替代性，例如各自特异性的依赖性的磷酸化位点以及DNA-PK对ATM的负向调节作用；也存在明显的合作性，例如在在A-T细胞中，ATR和DNA-PK可以一定程度上补偿ATM的缺失所带来的影响。通过全面的磷酸化修饰组学研究以及激酶motif分析，此研究对PIKK在DNA损伤反应中的作用网络进行了更清晰的绘制和描述。

磷酸化修饰组学

磷酸化修饰（phosphorylation）发生在细胞内超过30%的蛋白质上，是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍、也是最重要的机制。磷酸化参与各种生理和病理过程，调控细胞的增殖、发育、分化、凋亡等生命活动，广泛运用在信号通路转导、细胞凋亡、发育分化、癌症机理等研究领域。

景杰生物率先推出高深度磷酸化修饰定量分析，使用专有抗体靶向富集磷酸化修饰肽段，降低样本复杂性；结合严格的双重质控和生信分析，强强联合，广泛应用在生理病理下磷酸化机制研究。

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参考文献：

Sapir Schlam-Babayov et al., 2020. Phosphoproteomics reveals novel modes of function and inter-relationships among PIKKs in response to genotoxic stress. The EMBO Journal.

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