终极非靶向技术

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GCxGC和高分辨质谱的联用在哪些方面可以满足组学研究中更高分辨率的要求？

最近几年在我们研究团队内部，有关组学研究的兴起一直是个热门话题——部分原因是我们本身的专业特长正好可以在这个领域发挥一定的作用。对于分析科学界来说，代谢组学是一门特别具有技术挑战性的学科，需要运用多种高端新技术的各种交叉组合，包括液相色谱（LC），气相色谱（GC），质谱（MS）和核磁共振（NMR）。事实上，在代谢组学中，大部分分析工具都应占有一席之地。毕竟，在面对如此复杂的样品时，多模式才是唯一解决之道。

多维色谱在解决上述问题时占据了一个重要的位置，此时被讨论的话题包括如何能让多维色谱的分离能力能到更大程度上的增强。而这些讨论最终会归结为一个问题：单纯依靠超高分辨质谱和通过（色谱和质谱上）高分辨和正交分离的组合，哪个更好？

也许这个问题没有确定的答案，但希望我们的工作能说明全二维气相色谱（GCxGC）搭配高分辨质谱（HRMS）可以作为一种有说服力的选项。当这两种技术相结合，并拓展了多层次的正交分离，显著提高了未知化合物鉴定流程的多样性和可靠性，特别在目前还在起步阶段但正在快速发展中的呼吸气组学领域有很好的应用前景。我们将在下文中详细讨论。

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拼图的几个碎片

首先在色谱方面，线性保留指数（LRIs）提供了未知化合物鉴定的第一指标，通过跟商业化谱库（比如NIST，Wiley）中标准值的比较来实现定性。另外，线性保留指数也可以用于估计未知物的碳数。在GCxGC中，高度结构化的谱图模式提供了化合物的很多信息，包括碳数（沸点），极性，甚至是化学类别。

接下来是电离方式——这个过程连接了色谱分离和质谱分析的物理化学转化。电子轰击电离方式（EI）在GC分析中相对于LC有着明显优势，后者在峰标注上需要花费大量时间（1）（2）。实际上，EI提供了一种高度重复性的离子碎裂方式，而跟分析方法或仪器无关（3），而这可以让我们跟标准谱库中的离子碎片谱图进行比较检索，从而完成质谱定性。

最后，质谱检测器完成最后的鉴定步骤，对于质谱检测器来说，质谱分辨率和质量准确性和它的分析效率息息相关。对于所有类型的质谱仪器，这两个参数的指标都在不断提升（与色谱技术的发展完全独立）。

随着进十年来技术的成熟，全二维气相色谱-高分辨飞行时间质谱（GCxGC-HRTOFMS）开始越来越多地进入常规分析领域。一开始，这种技术被用于精细分析单个样品（4），后来随着数据处理方法的发展，并慢慢把低分辨数据处理方法应用到高分辨数据上，GCxGC-HRTOFMS 开始在多样品分析中发挥作用（5）。不管怎样，非靶向代谢组学是复杂分析的试验场；样品预处理和优化，质控的详细流程，大量数据的处理等等都存在不小的挑战。随着很多早期工作的慢慢积累，GCxGC-HRTOFMS 如今已经在代谢组学领域取得诸多成功（6）。我们团队也开展了很多不同的应用。

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血清研究

为了开发验证可靠的分析方法，我们对衍生化血清样品进行了分析。很多先驱学者，比如Fiehn团队，运用常规GC技术对该基质进行了充分深入的研究，并提供了后续研究所必须的坚实基础。

我们的第一步是优化和验证了一种模拟人类血浆的NIST标准物质的分析方法。在一个原理验证实验中，我们确认了跟克罗恩病（Crohn’s disease）相关的33种血清代谢物，证明了该方法的可行性。通过正交鉴定和确认，其中一半的代谢物可在代谢组学标准倡议（Metabolomics Standards Initiative）中进行二级置信水平的标注确认。现在我们正使用更灵敏的高速质谱检测器进行该项研究，希望能实现更少的样品量和更快的处理流程，这也是今后几年研究的重点。

我们更远大的目标是为这种通用基质开发一种多组学筛查平台。小分子可以通GC(xGC)进行分析，而其他有关样品的信息则可以通过LC(xLC)-MS或单质谱筛查完成。这些所有必要手段组合起来，可以最终揭开相关代谢途径的神秘面纱。

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空气中的研究

GCxGC-HFTOFMS 的另外一个重要应用领域是挥发物组学（volatilomics），这是有关在复杂体系中对挥发性有机物进行代谢类型筛查的研究。在通常情况下，针对小分子挥发物最好的分析手段是将其直接导入分析仪器中，这样可以避免冗长繁琐的样品前处理过程。在这方面，对捕集装置（包括固相微萃取纤维，热脱附管等）的持续研发和升级实现了对挥发性物质的有效采集。不过，对于挥发物组学的常规分析流程进行方法验证仍然存在挑战，主要是因为缺乏标准物质以及进行不同实验室对照测试的困难。

我们的研究团队已经开展了几项从食品到植物方面有关挥发物组学领域的非靶向应用，不过从最近五年开始，我们的目标转到了医疗领域。在这段时间里，我们开发了针对呼吸气分析的一套完整分析工作流程。

呼吸气研究是当前分析科学领域内一项正在发展但仍有很大挑战的应用。从采样开始到数据处理过程，所有相关步骤都需要被小心控制。采用的方法策略也必须根据不同的要求做出相应调整。GCxGC-HRTOFMS 技术是我们开展这种研究的理想仪器。而对于现场支持和诊断，直接质谱方法（比如选择离子流动管质谱，SIFT-MS，和质子转移反应质谱，PTR-MS）似乎是更快速和更适合的工具。

基于大量针对肺癌检测和炎症表型的研究，我们开展了首个针对呼吸气的大规模靶向和非靶向筛查研究（11）。我们通过建立体外模型确定了这些挥发性分子的细胞来源（12）。最后，在不同技术的协同作用下，这些关于挥发性分子以及在液相中更大分子的信息的深入了解，对于揭示多组学的全貌是至关重要的。

随着GCxGC-HRTOFMS 在非靶向代谢组学上的应用越来越多，这项技术的未来前景非常令人激动（6）（13）。但是，要使其真正成为一种在大规模非靶向筛查中的认可方案还存在诸多有待解决的问题。其中最大的挑战在于实验设计和数据处理流程，确保在大批量实验中每一次单独分析的可靠性和准确性都是一致的。这需要完善的质检流程（特别对于挥发性样品来说），对化学计量学工具的深入理解，以及可以管理从进样到结果输出的每个不同步骤的集成化软件解决方案。不过，所有这些挑战都不是该技术独有的，通过不同分析领域的通力合作，最终可以解决这些问题。

参考文献

1.    DJ Creek et al., “Metabolite identification: are you sure? And how do your peers gauge your confidence?”, Metabolomics, 10, 350 (2014). DOI: 10.1007/s11306-014-0656-8

2.    M Sindelar, GJ Patti, “Chemical Discovery in the Era of Metabolomics”, J Am Chem Soc, 142, 9097 (2020). DOI: 10.1021/jacs.9b13198

3.    NH Snow, “Basic Multidimensional Gas Chromatography”, 12. Elsevier: 2020.

4.    JV Seeley, SK Seeley, “Multidimensional gas chromatography: Fundamental advances and new applications”, Anal Chem, 85, 557 (2013).

5.    KA Perrault et al., “A minimally-invasive method for profiling volatile organic compounds within postmortem internal gas reservoirs”, Int J Legal Med, 5, 131 (2017).

6.    EA Higgins Kepler et al., “Advances in the application of comprehensive two-dimensional gas chromatography in metabolomics”, Trends Anal Chem,109, 275 (2018). DOI: 10.1016/j.trac.2018.10.015

7.    N Di Giovanni et al., “Untargeted Serum Metabolic Profiling by Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography–High-Resolution Time-of-Flight Mass Spectrometry”, J Proteome Res,19, 1013 (2019). DOI: 10.1021/acs.jproteome.9b00535

8.    N Di Giovanni et al., “Specificity of metabolic colorectal cancer biomarkers in serum through effect size”, Metabolomics, 16 (2020). DOI: 10.1007/s11306-020-01707-w

9.    J Beauchamp, CE Davis, J Pleil, “Breathborne Biomarkers and the Human Volatilome”, 2. Elsevier: 2020.

10. FN Schleich et al., “Exhaled volatile organic compounds are able to discriminate between neutrophilic and eosinophilic asthma”, Am J Respir Crit Care Med, 200, 444 (2019).

11. R Pesesse et al., “Multimodal chemometric approach for the analysis of human exhaled breath in lung cancer patients by TD-GC×GC-TOFMS”, J Chromatogr B, 1114, 146 (2019).

12. D Zanella et al., “Comparison of the effect of chemically and biologically induced inflammation on the volatile metabolite production of lung epithelial cells by GC×GC-TOFMS”, Analyst, 145, 5148 (2020).

13. BA Weggler at el., “Comprehensive two-dimensional gas-chromatography to study the human exposome: Current trends and perspectives”, Curr Opin Environ Sci Heal, 15, 16 (2020). DOI: 10.1016/j.coesh.2020.02.011