科研 | Nature子刊：炎症性肠病中肠道菌群结构及代谢活动变化

原名：Gut microbiome structure and metabolic activity in inflammatory bowel disease

译名：炎症性肠病中肠道菌群结构及代谢活动变化

期刊：Nature Microbiology

IF：14.174

发表时间：2018.12.10

通信作者：Curtis Huttenhower；Ramnik J. Xavier

通信作者单位：麻省理工学院，哈佛大学

炎症性肠病（IBD）是一种胃肠道慢性疾病，由肠道微生物和肠道免疫系统交互作用的变更所引起。溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）是IBD中常见的亚型代表，分别于大肠和小肠处发作，同时具有独特的微生物群落特征。之前的研究已表明，IBD患者的肠道菌群结构发生了显著变化。同时，菌群结构能够通过代谢物的方式改变结肠生态环境，而这些代谢物可以对机体信号通路、免疫系统调节或者抗菌活性起到影响作用。然而，特定的微生物和它们所调控的小分子，与引发、维持、缓解或者炎症的预测如IBD之间的相互作用关系并不清楚。

大体上，肠道代谢物的特征由饮食，人体代谢物以及微生物代谢物共同决定，而这些物质能够塑造微生物群与宿主之间的相互作用关系。例如，通过肠道细菌消化分解的膳食纤维，能够转化为短链脂肪酸（SCFAs），如丁酸、乙酸和丙酸。SCFAs能够通过调节组蛋白脱乙酰酶抑制活性、基因表达、细胞增殖以及免疫应答来影响宿主细胞。此外，丁酸可以通过调控T_reg细胞产量以及增强巨噬细胞抗菌活性来抑制结肠炎症。IBD患者粪便中的丁酸含量显著下降，对应的丁酸产生菌数量也在下降，这说明SCFA在调节系统免疫功能中具有重要作用。

共生微生物也可以通过对可利用代谢物进行改变，进而调整宿主产生的信号分子。无菌小鼠的非靶向血清代谢组学相比于传统小鼠表现出更多血清代谢物水平的上升，这是因为共生微生物的作用。例如，色氨酸代谢水平受到肠道微生物的显著影响，通过微生物的色氨酸脱羧酶作用，食物中的色氨酸转变为色胺和其他小分子。微生物衍生的色氨酸代谢物不但能够通过降低色氨酸的利用率（这会导致血清素产量的紊乱），而且还会产生吲哚类衍生物来激活芳烃受体，进而改变宿主生理学功能。有研究表明，CD患者的微生物组样本中，与色氨酸代谢有关的基因表达水平均有所下降。最近的一项小鼠实验研究表明，缺乏了IBD敏感性基因中的一个基因CARD9，可以改变小鼠色氨酸的微生物代谢方式，进而使其更容易感染结肠炎。

不少研究表明IBD患者的粪便代谢物各有差异。然而，这些研究都是以小部分或者简单的16S rRNA扩增子测序为基础来解析IBD相关的微生物群特征（也就是说，缺乏鸟枪宏基因组信息）。有研究表明，16S rRNA微生物组测序与非靶向粪便代谢组学结合起来，分析效果要优于靶向代谢组学。在一项非活跃性儿科IBD研究中发现，与IBD相关的菌群种类和代谢物表型之间存在高度相关性。同样的研究发现，健康的直系血亲，其微生物组和代谢物表型与具有非活动性疾病的其他亲属相似。与健康个体肠道菌群多样性相比，CD和UC患者的肠道微生物组群均表现出菌群多样性的下降，主要伴随着厚壁菌门中门水平的下降以及变形菌门中门水平的上升。CD患者的菌群，尤其是梭菌属比例的变更：毛螺菌科和疣微菌科中罗氏菌属和粪杆菌属比例的下降，而活泼瘤胃球菌比例上升。综合来看，目前的这些研究结果表明肠道代谢组还没有特征性的分子关联着炎症和最终的IBD，而这些分子可能主要是微生物衍生的或者修饰下的产物。

本研究，我们采用客观公正的方法来鉴定IBD患者和非IBD健康对照中肠道代谢物，微生物种类以及微生物酶的差异。采用非靶向LC-MS代谢组学分析方法和鸟枪法宏基因组测序技术来解析来自于由155位组成的发现队列，和65位组成的验证组的粪便样本，且每一组对于UC、CD以及正常对照病人均有截面采样指标测试。宏基因组学分析结果和以往的大多数研究相一致，代谢组学分析发现IBD中有超过2700个差异丰富的代谢物，包括了224种代谢物（UC和CD组）水平显著升高。与IBD相关的升高代谢物，如鞘脂类和胆酸类，以及很多特征不明显的代谢物的富集很可能是源于微生物。的确，许多差异丰富的代谢产物与差异丰富的微生物群和酶类密切关联，这也暗示了它们之间的生物学机制与丰度关系。最后，对来自发现队列和验证组的绝大部分IBD进行多次重复试验，可以确定，通过微生物组和代谢扰动对IBD进行分析，是一种行之有效的方法。

为了解析IBD患者肠道代谢物及菌群结构的特征，我们收集了已登记的患者粪便，并进行分析。155例病人中：68例患有CD，53例患有UC，34例IBD对照（Fig.1a）。每份粪便样本在做完宏基因组分析后，随后进行菌群结构种类组成和功能性分析。此外，采用四种LC-MS方法对样品中的极性代谢物、脂质、游离脂肪酸和胆酸进行测定。非靶向模式中，采用高灵敏性高分辨率质谱仪进行LC-MS代谢组学分析，可以捕获大量已知和未知代谢物，包括那些很可能源自于微生物代谢所产生的物质。

图1. IBD个体的肠道多组学特征变化。a，两组IBD中粪便宏基因组和代谢组分析：含有155例的发现队列（PRISM）和含有65例的验证组。b，以肠道代谢组学特性（Bray–Curtis 距离）为基础进行PRISM队列中个体的PCoA分析。c，相同个体在肠道宏基因组物种特性之间的Bray–Curtis距离。d,e，患者粪便中钙网蛋白水平（μg g⁻¹）分别对应b，c中的第一个PCoA轴线。注：钙网蛋白的测定并未包含所有患者。

以人类代谢组数据库（HMDB）中的数据为比对基础，对检测出的3829种代谢物特征（占总比43%）进行推断比对定性。通过与内部化合物数据库所产生的参考资料进行比对，确定并标注了466种特征（代表346种独特化合物）为标准物质。对鸟枪法宏基因组学和代谢组学数据进行分析，（1）鉴定IBD-与其亚型疾病患者的微生物及代谢物变化特征，（2）描述微生物特征和代谢物特征之间的关联性，（3）总体评估这些特性指标是否能够有效且准确的反应出IBD及其亚型疾病的症状及活性水平。PRISM中，独立确定了20位CD患者，23位UC患者以及22位正常对照（来自荷兰）。具体数据及分析结果如下所述。

IBD患者中与宿主炎症相对应的广谱代谢物变化

155位PRISM病人，超过8000种代谢物特征在非IBD对照和CD病人之间存在差异性的变异模式，这说明两种表型之间的代谢物存在显著差异（Fig. 1b），而这种差异是源于多种数据组合，包括了宿主组织中病变活动，IBD中微生物组改变引起的活性以及患者饮食和用药等。UC患者代谢物特征呈现出更为广的分布，大约有一半的代谢物特征类似于非IBD对照，而剩下的则更偏向CD患者的代谢物特征。相似的变化趋势也表现在微生物种群结构上，以及来自患者对应的宏基因组（Fig. 1c）。具体来说，分类的第一个轴对应的两个数据集具有高度的正相关性（Spearman’s r = 0.664，two-tailed P < 10⁻²⁰），这与肠道代谢特征，菌群结构特征以及疾病状况相一致。

我们假设代谢物特征在每个人中均表现出广度的变化，尤其是在UC患者中，这可能是导致活动性炎症在个体水平上存在差异的一部分原因。通过将代谢物变化第一轴与个体粪便钙网蛋白（IBD中的炎症标记物）水平进行比对，进行评估。对93例病人中粪便钙网蛋白进行测定，发现代谢物变化第一轴与粪便钙网蛋白之间具有较强的关联性（Spearman’s r = 0.486, two-tailed P < 10⁻⁶; Fig. 1d）。导致这种关联的部分原因，是对照组个体的钙网蛋白水平非常低（均值=35 μg g⁻¹），而CD患者中水平非常高（均值=130 μg g⁻¹）所造成。然而，在评估UC患者时，同样存在这种高度显著相关性。在粪便钙网蛋白测定和宏基因组变化第一轴中，我们同样发现这种相似的趋势（Fig. 1e），由此得出结论，UC患者不同于对照组的炎症水平，而是表现出更多的活动性炎症；其次，这种变异可能会引起UC患者更多的异构代谢和宏基因组特征变化。

代谢组学和微生物分类变化的第一轴也与香农多样性存在显著相关性。与之前的结果相一致，更多的炎症，类似于IBD样本（Fig. 1c），表现出香农多样性的显著下降（(Spearman’s r = − 0.572，two-tailed P < 10⁻¹⁴，n = 155）。相似的，在代谢物特征中同样观察到了这种趋势（Spearman’s r = − 0.321，P < 10⁻⁴，n = 155），总体上表现出较小的样品内多样性变异，虽然趋势较弱。值得注意的是，这些相互关联的多样性不足以说明代谢组学第一轴和分类变异之间真的具有强耦合作用。

PRISM（发现队列）中的68例CD患者依据其疾病情况分为不同小组：L1（回肠，n=14），L2（结肠，n=22），L3（回肠结肠，n=29），L1+L4（回肠+上消化道，n=1），未知的（n=2）。对于从CD和非IBD中筛选出个体的代谢组和宏基因组数据进行分析，我们发现在CD患者中，几乎没有观察到依据疾病情况的未分层现象。更确切地说，综合诊断（CD/UC/非IBD）结果表明，个体之间的代谢组和宏基因组特征变异情况表现出统计学上的显著性差异分值（方差排列分析，P < 10⁻⁴），而疾病情况在CD患者中并未表现出显著影响（P = 0.22和P = 0.35），可能是因为PRISM队列中IBD的既定性质。基于这个结果的发现，在随后的数据分析中，我们把CD作为单一诊断来处理和分析。

IBD与对照表型之间代谢物富集度的差异

为了在更高分辨率的水平上仔细分析IBD患者代谢物变化特征，我们采用多元线性模型去对应每种代谢物特征，以考查其与IBD表型之间的关联性，并控制其他的协变量（年龄和用药）UC-和CD-的特定效应的P值采用多重假设进行修正（FDR 0.05）。尽管采用了这道严格的过滤程序，在IBD中还是有2729种丰度显著不同的代谢物特征（31%），包括200种与151种标准物不匹配的代谢物。在所有差异丰富的代谢物中，与非IBD对照相比，绝大部分（1931；71%）在IBD（CD或UC）中显著降低；而在CD和UC中，有224种（8%）显著升高；在CD中，有505种（19%）表现出极显著升高；而在UC（UC患者的更多异构代谢特征引发的可能性结果）中只有69种（3%）表现出极显著地提高。大量个体差异丰富的代谢物与IBD患者代谢物特征中的较大变化之间存在相一致的关系（Fig. 1b）。

图2. IBD和对照表型中代谢物的丰度差异。采用魏克森讯号等级检定来评估个体代谢物差异丰度趋势，以确定IBD中富集丰富的分子类别。a，专注于至少有10个假定种类的分子类别（见N列），8种在CD中（FDR q < 0.05）正富集显著，表明这些种类在CD中丰度更高，17种呈反富集显著，表明这些种类在对照中丰度更高。b，UC和对照中的子集之间相比这些种类丰度同样显著。虚线表示个体代谢物特征的显著性阈值（abs(t) > 2.61）。c-h，68例CD，53例UC和34例非IBD对照中个体差异丰富标准衡量示例。c-f高亮的代谢物表示a和b中的典型代谢物。每种LC-MS方法中单独以及集中后丰度用ppm表示；用可视化方阵表示数值。箱型图“boxes”表示第一，第二，第三分位数值。“whiskers”表示数据内栏，而内栏外的点认定为离群值。

采用富集分析（魏克森讯号等级检定）来确定混合物质的大类，这些混合物质在IBD表型中表现出显著地中低等丰度。以HMDB注释为基础，确定了代谢物质的分类，并聚焦于97种代谢物，关联了至少数据集中的10种假定类别。在这些类别中，经过多假设检验之后（Benjamini–Hochberg FDR q < 0.05），收集IBD或者非IBD中表现出统计学上显著性的富集类别。97种分子类别中的8种在CD中表现出显著地高丰度，在鞘脂类、甲亚氨酸以及胆酸中观察到的效果最强（Fig. 2a）；7种在UC中表现出额外的明显过剩，虽然苯乙醯胺类得以提高，但未达到统计学上的显著水平（Fig. 2b）。UC中没有出现特别地过剩分子类别。

IBD富集型胆盐包括了胆酯（q = 0.003）和鹅脱氧胆酸盐（q = 0.0002；Fig. 2c）。健康人群肠道中，这些初级胆酸能够在脂类中消化，并通过微生物的去结合作用转化为次级胆酸。在CD中，我们观察到了解离态的次级石胆酸盐和脱氧胆酸盐之间互补作用的消失或者损耗，但这种变化并不符合FDR显著性分析的临界值（q分别为0.06和0.13）。IBD患者肠道中初级胆酸的相对过丰这一特点与IBD微生物组中胆酸转化活力的破坏相一致。鞘脂类，是IBD中另一种过丰类物质，在健康人体肠道中扮演多重角色，包括（1）肠细胞膜结构成分；（2）细胞分化中的重要信号分子。除了存在人体细胞膜上，鞘脂类也普遍存在于拟杆菌细胞膜上，而这些微生物衍生的鞘脂类能够调节恒定的自然T细胞的数量。之前的研究表明，鞘磷脂的代谢在IBD中会被干扰和破坏，导致特殊鞘脂类物质的累积，进而诱发炎症水平的升高。这些物质中，神经酰胺和鞘磷脂（Fig. 2d）在CD和UC中均表现出显著地过丰水平（q < 0.02）。

相比于对照，CD和UC中的很多分子物质类别显著下降（Fig. 2a，b）。三萜类和长链脂肪酸（LCFAs，包括羟基十四烷酸，Fig. 2e）是下降最多的两类（分别为135和111），而phenylbenzodioxanes和胆固醇（包括胆甾烯酮）是最稳定的下降类别（它们中的大多数在CD中下降显著）。Phenylbenzodioxanes主要源自于水果，这一结果加固了原有概念，即一些能够检测到的代谢物变化是个体饮食变化的结果。三酰基甘油（TAGs），包括C54:6 TAG（Fig. 2f），相比于CD和UC患者，在对照中富集水平较高。这种变化，结合LCFAs和胆固醇的富集水平，与之前报道的IBD中脂肪酸代谢的潜在扰乱相一致。

然而它们的分子类别在IBD中的富集程度并不是普遍存在差异的，还有其它显著不同的代谢物如乳酸（IBD上端；Fig. 2g）和泛酸（IBD下端；Fig. 2h）。之前有报道表明在CD和UC病人中乳酸有所升高，主要是由IBD肠道微生物组中的某些成员所产生，包括乳杆菌、肠球菌以及片球菌。泛酸（维生素B5）是辅酶A的前体物质，存在于脂肪酸的代谢过程。而且，健康人群肠道能够产生泛酸；因此（像乳酸），它在IBD患者体内丰度的差异可能预示着肠道微生物与代谢物之间的关系被打乱，这一点我们后面详细探索。在这个队列中虽然没有统计学上的显著差异，但相比于对照组，SCFAs类中的丁酸和丙酸在UC和CD患者体内均有所下降。

IBD患者化学相关的物质模块紊乱

为了进一步探究2729种差异丰富代谢物的潜在生物学模式，我们以线性模型中相似残差为基础，对差异丰富的代谢物进行集合。这种方法可以使代谢物共聚并转向为共变，这种共变与IBD表型、年龄以及用药无关。共确定了1403个这样的聚类（mean intracluster Spearman’s r > 0.7）。每个聚类被指定为一种代表性代谢物：即聚类中心或者最接近中心的标准代谢物（适用情况下）。50个最大的聚类代表了780种差异丰富的特征物（占整体的29%），与少数的生物信号相一致，表明有许多差异丰富的代谢产物。

共变代谢物的聚类能够在多种机制的共同作用下提高，包括了：（1）共同亲本代谢物的化学修饰；（2）通过生化途径进行的代谢物互作；（3）特定微生物引导的代谢物共产；以及（4）来源于特定饮食的代谢物。代谢物共变产生的生物信号，特别是来自于代谢物互换的那部分信号，能够被用来将注释代谢物对应的信息传递到它们未注释的部分。这种“连坐”原理也出现在基因共表达数据中，可用于确定功能性相关基因的模块并预测功能基因的分配。根据这种逻辑，我们发现了共聚类代谢物具有更相似的2.7×保留时间、3.0×质荷比以及15×更可能属于相同的化学种类（相对于随机代谢物配对）。因此，聚