高效液相色谱柱的种种

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高效液相色谱柱的种种

高效液相色谱仪系统中，色谱柱起着分离作用，是色谱仪分析系统的核心部件，色谱柱柱效的高低影响着检测速率的快慢以及检测结果的准确性。

1. 高效液相色谱仪色谱柱的结构：

色谱柱空柱是由柱接头、柱管及滤片组装而成。柱接头是两端螺纹组件，采用低死体积结构，一端是7/16英寸外螺纹，另一端是3/16英寸的内螺纹 (国内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压环用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸 (Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，提高色谱柱柱效。在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通 过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2．5mm长或 其他固定尺寸)。

在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受 一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。

2. 高效液相色谱仪色谱柱的填料：

液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，液相色谱柱的分类是依据填料类型而定。

正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外形可分为无定型和球形两种，其颗粒直径在3—10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。

反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10 μm之间。

3. 高效液相色谱仪正相色谱柱的使用方法

1.新柱子可直接用流动相。推荐先用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速冲10倍柱体积，再根据流动相选用极性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速冲10倍柱体积，最后换成流动相；

2.正相使用时，不宜分析含醛基、羰基的化合物，不可用于还原糖的分析；流动想要彻底脱气，并不得含有羰基化合物和过氧化物（质量不好的乙醚、四氢呋喃含有少量）；

3.任何时候更换流动相时都要确保新流动相与柱子原保存液可互溶。

4.  高效液相色谱仪反相色谱柱的使用方法

1.先用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速冲10倍柱体积，再依次以相同的流速相同的用量用氯仿、异丙醇、甲醇、甲醇-水（50：50）冲柱子；

2.以0.5ml/min的流速用30倍柱体积的pH11.0的氢氧化钠（LUNA）水溶液冲柱子（注意pH值切不可超过11.0），立即用水（ 0.5ml/min的流速，30倍柱体积）冲洗，再换成流动相；

3.配制流动相时，应各组分分别量取，比例较小的组分要精密量取，需调pH值时要精密到0.1；

4.反相条件下使用时，要特别注意控制pH值范围，pH值越低越有发生水解的危险，流动相中水的比例越高当然也越有发生水解的危险。最理想的pH范围在pH 3.0-7.0；

5.如果要使用的流动相中还含有缓冲盐类，建议在用分析流动相之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，这样可避免缓冲盐在分析柱内的析出。

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5.  色谱柱是否可以反冲，那什么柱子可以反冲，什么不可以?反冲后是正着用，还是反着用?

一般的正相、反相柱应该都能反冲，只有两端筛板孔径不对称的柱子不能反冲。可不可以反冲得看你的柱子两头的孔径是否一致，若不一致肯定不行。一般来说，低流速反冲是没有任何问题的。因为柱子在制备的时候，是在40MPa左右条件下进行填充的，1.0ml/min的流速的柱压顶多十几MPa，怎么可能对柱床造成明显的影响呢？有人说：“反冲可能使键合相碳链一边倒，与原来的方向相反，会影响柱子的分离效果。”  众所周知，只有碳链在完全自由舒展的条件下，柱效是最好的，照上面的说法，反冲不刚好把碳链恢复到自由舒展的状态，这样不更好吗？其实，实验早已证明：在至少5%的有机相中，碳链是可以完全自由舒展的。正冲则可能污染整个柱子。反冲是为了把柱头的污染物冲洗掉，反冲后还是正着用比较好，以免柱子的两头都被污染。

6.  对于一根常用的c18 柱，拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护?为什么要这样做?

新柱活化，实际上是一个平衡的过程，除了用流动相平衡外，有时候还必须用所测样品对新柱进行平衡，特别是测定分子量比较高的多肽，尤其重要。因为分子量高的物质分子，扩散速度慢，平衡所需时间也相应较长。具体平衡方式也很简单，多进几次样品，直到峰面积和保留时间稳定，再进行正式进样测定。如果要加快平衡时间，把前面用来平衡的进样样品浓度加大，或者不等洗脱完成，连续进样多针。用待测物对新柱平衡，目的是将硅胶基质填料表面具有非特异性吸附的位点的吸附能力饱和掉。

7.  如果柱子取下来放置一段时间，需要做什么保护吗?

对一般的反相柱，也就是洗干净后放到纯甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中，然后用堵头塞紧柱两头，以免保存溶剂挥发，应该不需要做特殊的保护。

8.  多个样品不好不离的时候，请问该怎么通过选择合适的柱子来提高分离度?

提高分离度可从三个主要影响因素来考虑，柱效、选择性和保留因子。可通过减小填料粒径和增加柱长提高柱效;选择性和固定相选择以及pH 条件有关，通过选择合适的色谱柱和合适的pH，可以提高选择性;有时候适当延长出峰时间增加保留因子，也可提高分离度。

9.  因为不知道流动相已走完，液相色谱柱空走了大概一晚上，请问这种情况下柱子还能用吗?如果可以应该如何再生?

能用的。可能柱子里会有气泡进去，但之后多用流动相冲冲，看到基线稳定，就没问题了。用色谱柱的保存液低流速长时间冲洗，然后再检测一下柱效，看柱子是否恢复，液相最好设置一下最低压限，这样就不怕流动相走光而会损伤色谱柱。

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完

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