【微学堂】Z因子：高通量实验评估和验证的有力工具（内含视频教程）

2020-07-20 17:25:03, 美谷分子仪器美谷分子仪器（上海）有限公司

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1999 年，Zhang 等人首次提出了一个简单的统计参—— Z 因子，自此之后，Z 因子成为高通量筛选（HTS）实验评估和验证中使用最广泛的参数。它为任何生物测定法，尤其是 HTS 测定法的质量分析，提供了一种简便而有用的度量标准。

Z 因子的由来

高通量筛选技术（HTS）是 20 世纪 80 年代后期发展起来的一种药物筛选的新技术，逐渐成为新药发现中必不可少的过程。能够准确，快速地从大型化学物库中鉴定活性化合物（“Hits”）的能力在很大程度上取决于筛选中使用的测定方法的适合性或高质量。

由于每种测定方法的性质以及由仪器和人为相关的随机误差引起的扰动，测定中的所有测量值都包含一定程度的可变性，客观上，测量变化越小，所鉴定出的 Hits“真实”的置信度就越高。

因此，在设计和验证 HTS 分析时，引入标准偏差（SD）或变异系数（CV）等指标作为参考标准，能大大增加测定方法的可靠性。在当时，有两种指标用来宽松地表示测定的质量：一个是信号与噪音的比值（S/N），另一个是信号与背景的比值（S/B）。

S/N 的表达式定义为：

S/N=(mean signal-mean background)/SD of background,

根据这个定义，S/N 仅表示可以将信号视为真实的置信度，即与相关的背景噪声不同；第二个S/B的表达式定义为：

S/B=mean signal/mean background

这两个指标都没有充分考虑到样品和背景测量的可变性以及信号的动态范围，因此都不能很好的反映测定质量。

直到 1999 年，Zhang 等人定义了一个“Z因子”作为度量标准，该系数既反映了测定信号动态范围，又反映了与信号测量相关的数据变化，因此适用于测定质量评估。

Z 因子是无量纲的参数，因此适用于不同测定分析的比较。Z 因子不仅为比较和评估分析的质量提供了有用的工具，还可用于分析的优化和验证。

Z 因子的方程式

通常在验证典型的 HTS 分析时，将未知样品与参考对照一起进行分析。

样品信号是指给定测试化合物的测量信号；阴性对照（通常称为背景）是指来自提供最少信号的对照孔的一组单独测定；阳性对照是指来自提供最大信号的对照孔的一组独立测定。

在验证测定中，运行包含阳性和阴性对照的多个测定板，评估在活性范围的两个极端情况下的可重复性和信号变化，然后计算它们各自的样品、阳性对照和阴性对照的均值和SD，其中阳性对照平均值与阴性对照平均值之间的差异定义了测定信号的动态范围。

由此Z因子的方程式定义为：

对于激动剂/激活类型的实验分析，方程式中的对照数据将替换为阳性对照（最大活化信号）数据；对于拮抗剂/抑制类型的实验分析，方程中的对照数据用阴性对照（最小信号）数据代替。其中分母上的 I mean of sample-mean of control l 定义了筛选的可用动态范围，并且是两个信号均值的差值的绝对值。

Z 因子对数据可变性以及信号动态范围都敏感。例如，当（3 SD of sample + 3 SD of comtrol）接近零，即非常小的标准偏差，或者当 I mean of sample-mean of control l 接近无穷大时，Z因子趋于统一（Z 的最大值），这是 HTS 分析接近理想的分析，这与人们的直觉一致，即“好”的测定法具有较大的动态范围和/或较小的数据可变性。

对于任何 HTS 测定系统，Z 因子可以是小于或等于 1 的任何值（-∞<Z <= 1）。Zhang 等人给出了一个筛选试验各自 Z 因子值的简单比较（表 1），在 0.5≤Z<1 的情况下，测定系统中样品信号分布与参照信号分布的分离程度良好，这表明此分析方法非常好；0 <Z <0.5 表示中等程度的分布分离，表明可进行分析；Z = 0 表示分离差，是“是/否”类型的测定；对于 Z <0，基本上不可能进行筛选。

表 1. 根据 z 因子的值对筛选分析质量进行简单的分类

Z’ 因子的定义和方程式

影响分析质量的因素不仅包括仪器和实验条件（如试剂、方法等），还包括日常的环境和不同用户操作方面的差异，这些对信号及信号变化产生影响的条件要进行测定优化，以确保测定形式可以正确实施，并且测定将具有足够的动态范围和可接受的信号可变性，并能提供有用的数据。在测定方法的分析开发中，可以仅使用阳性对照和阴性对照来进行计算 Z’ 因子。

Z''因子类似地定义为：

Z'' 因子是测试本身质量的特征参数，无需测试化合物的干预。因此，Z'' 因子是任何给定测试的统计特征，不限于 HTS 测定。对于所有带有适当选择的阳性和阴性参照对照的大型数据，都是 Z <= Z''。Z'' 因子可用于分析开发和优化中的质量评估。

例如，如果 Z'' 值很小（负值或接近零），则通常表示测定条件没有得到优化，或者设置的测定形式不可行，无法生成有用的数据。例如在药物筛选实验中，在相同条件下对相同测定的 Z’ 和 Z 值进行比较，可以看出化合物库对测定的影响。

如果 Z'' 值大但 Z 值相对较小（ Z'' 和 Z 都大于 0 ），则可能表明化合物库和/或用于筛选的化合物浓度需要进一步检查或优化。因此，Z'' 因子适合评估整体测定质量，而 Z 因子则反映了针对已定义了筛选条件的特定HTS的质量。

单个 Z'' 因子的测量不足以对测定质量进行最终评估。在实际应用中，应进行三个或更多 Z'' 因子的测量，最好由不同的操作人员在不同的日期进行，以获得对总体测定质量的准确评估。

Z'' 因子实验还可用于跟踪测定质量的变化，或确定对测定不可避免的变化的影响，例如试剂供应商的变化。

综上所述，在评估，比较和验证任何生物测定法，特别是 HTS 测定法时，都可以使用Z因子。在 HTS 分析设计之初，尽管还需要考虑其他方面例如试剂的可用性，筛选的时间线和成本等，Z 因子仍然可以作为确定 HTS 检测适用性的简单而有用的参数，尤其是在实验开发时，Z‘ 因子还可用于分析评估和验证。

如何使用 SoftMax Pro 软件中的

Z 因子测定模板

*视频时长：4’19”

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关于 Z 因子的测定，在 SoftMax Pro 软件的程序库中可以找到相应的模板，具体路径是点击 Protocol Manager—Protocol Library—Assay Development—Z factor Assay Development，打开这个模板，首先我们看到的是对这个模板的使用介绍。

在本模板中，Z 因子有两种测定形式，一种是需要加入未知样本，采用样本的最高信号值和最低信号值以及它们的标准方差进行 Z 因子的计算；一种是不需要加入未知样本，只需要阳性对照和阴性对照，采用阳性对照的信号值和阴性对照的信号值以及它们的标准方差进行 Z‘ 因子的计算。对于 Z 因子和 Z’ 因子的详细介绍可以看微信文章中的内容。

下面具体讲一下怎么使用这个模板，首先打开 Plate1 ，如果做整板测试，需要在 setting 里，更改一下读板区域，选择全板。

这个模板默认的是荧光检测模式，在实际应用中，可以选择任何的检测模式。点击 OK，退出设置界面。

为了更好的说明这个模板，我从 Excel 里导入一组数据进来，复制数据，点击任一孔，右击，粘贴数据。

我需要对这组数据进行样品分组，点击 Template Editor，我的数据中第一列是阳性对照，选择阳性对照组（PosC），点击确认（Assign）。

第 2-11 列是我的样本组，选择样本（Sample），我的样本组是有浓度梯度的，初始浓度 3000uM，5 倍稀释。

最后一列是阴性对照，点击确认，点击OK，这就分好组了。

在左侧下面的阳性对照，和阴性对照的数据表格中，平均值和标准差都已经计算出来了。

在样品表格中，AVG 是信号值的平均值，SD 是信号值的标准差，这一组（AvgActivation）是激活效率百分比的平均值，根据样品的浓度和激活效率百分比可以进行曲线拟合。

这个模板中，使用的拟合方式是四参数曲线拟合，在实际应用中，可以在拟合方式列表中，选择其它的拟合方式。

在 Results note 里，Z 因子和 Z‘ 因子的测定结果已经出来了，只要 Z 因子和 Z‘ 因子大于 0.5，这个实验方法和测试条件就是成立的。适合于四参数拟合的数据，可以直接得出 EC50 值。

好了，今天的微学堂关于 Z 因子的测定模板的讲解就到这里了，谢谢大家。

参考文献

Zhang, Ji-Hu., Chung, T.D.Y. and Oldenburg, K.R., A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal Biomolecular Screening 4:67-73 (1999).