Get新技能 ｜UPCC轻松搞定脂质鉴定及碳-碳双键定位

近年来，质谱（MS）技术已成为脂质组学研究的广泛和关键应用平台，采用相应平台进行脂质组学的研究已成为脂质分析的常态。如图1所示，展示了以PC（34：1）为例的脂质研究现状，利用质谱技术可实现脂质的种类、脂肪酰基/烷基组成，甚至脂肪酰基/烷基链的sn位置信息的鉴定。，但是如何定位与定量脂质化合物不饱和脂肪酸链上的碳碳双键（C=C）仍有一些技术难点尚需攻破^[1]。

图1.以PC（34：1）为例的脂质研究现状示意图

文献报道，对于一些含不饱和脂肪酸的脂类化合物，即便它们分子量相同，其生理作用也会因C=C位置不同而有差异^[2,3]，因此解决不饱和脂肪酸链上C=C位置的鉴定及定量分析成为深入研究脂质功能及与疾病相关的有力工具。

近年来，清华大学的瑕瑜团队率先报道了使用Paternò-Büchi （PB）光化学反应，借助液质联用平台，能够快速对复杂脂类混合物中的不饱和脂质进行定性分析，同时对C=C位置进行鉴定和定量研究^[4-6]。另一方面，采用UPC²-MS（超高效合相色谱-质谱）连用技术，可以同时分析和鉴定极性和中性脂质^[7]。沃特世联合清华大学瑕瑜团队及清谱科技，共同开发了UPC²/QTof MS系统结合PURSPEC Ω Analyzer 光化学反应器的脂质分析方案。该方案可同时分析中性和极性脂质，并对脂肪酸链上的C=C双键位置精准鉴定。希望能为研究脂质的小伙伴们提供脂质研究的新思路和新技能。

PURSPEC Ω Analyzer + Waters超高效合相色谱系统（Acquity UPC²）+ Waters四极杆飞行时间串联质谱（QTof）系统（图2）。方案中结合离线流动微反应和紫外光照射实现对脂质的光衍生化，收集经Ω Analyzer反应后的样品溶液，进样UPC²/QTof系统进行检测分析。

图2.   Ω Analyzer-UPC²-QTof脂质鉴定平台

本研究以7种（TAG、DAG、PG、PE、PS、PI、PC）脂质混标、牛肝以及猪脑脂质提取物溶液（100 µg/mL）为研究体系，展示研究的思路和流程。

首先，将提取后的脂质样品和PB试剂（3 mM）溶于乙腈/20 mM醋酸铵水溶液（v/v, 50/50）中，流经Ω Analyzer，进行PB光化学反应，收集反应后的样品溶液。然后采用UPC²-QTof系统进样分析，分析方法中采用Waters UPC² Viridis BEH (3*100 mm，1.7 µm)色谱柱，梯度洗脱。

如图3所示，图3a为7种脂质的混标在UPC²分离的总离子流图。UPC²色谱分离一针进样可实现极性和非极性脂质的同步分离，同时亦可看出本方法使用的流动相体系显著改善了PI和PS的峰形。图3b和图3c分别为猪脑和牛肝脂质提取物在UPC²分离的总离子流图。可以看出，UPC²色谱分离可使不同脂质成分按脂质种类成簇分离，9类脂质均有良好的保留和峰形，它们的洗脱顺序为：TAG、DAG、PG、PE、PI、PS、PC、SM、LPC。如此对脂质的PB反应产物进行分析时，不会有不同脂质成分间的干扰。

图3.   脂质混标和脂质提取物样品的总离子流图

a：7种脂质的混标，b：猪脑脂质提取物，c：牛肝脂质提取物；图中所标：TAG为甘油三酯，DAG为甘油二酯，PG为磷脂酰甘油，PE为脑磷脂，PI为磷脂酰肌醇，PS为磷脂酰丝氨酸，PC为卵磷脂，SM为鞘磷脂，LPC为溶血磷脂酰胆碱

如图4所示，不饱和脂质与羰基化合物在紫外光的照射下能够发生PB反应，在双键位置形成四元环状结构，从而得到一对同分异构体（P₁和P₂），所得产物经质谱分析，在碰撞诱导解离作用（CID）下分别得到含羰基（^xF_A）和含烯烃（^xF_O）结构的诊断离子，x表示C=C所在位置，这一对分子具有特征固定的质量差。由此可对不饱和脂质的精细结构进行判断。

图4. PB-MS/MS示意图

如图5所示，以牛肝脂质提取物样品中PC(34:2)为例对PB-MS/MS分析过程进行展示，其对应谱峰出现在洗脱区间6.00-6.25 min内。根据正离子模式下一级谱中[M+H]+的精确质量数和洗脱时间可指认分子式和所属亚类。在质谱负离子模式下，对[M-H]-进行CID分析，生成碎片离子m/z 253，255，279和281，从而得到脂肪酸链的组成信息，即PC 16:0_18:2和PC 16:1_18:1。然后对经PB反应衍生后的样品[M+R+H]+进行分析，CID谱图中有两对丰度较高的诊断离子m/z 650/792和 m/z 690/832，分别对应PC 16:0_18:2上9位及12位的C=C键；另外两对诊断离子m/z 676/818和 m/z 648/790，则表明PC 16:1_18:1的两条碳链上C=C键均位于9位。即PC 34:2中包含PC 16:0_18:2 (Δ9, 12)和PC 16:1 (Δ9)_18:1 (Δ9)。

图5.  牛肝脂质提取物样品中PC 34:2反应产物的CID谱图

Waters ACQUITY UPC²可一针进样同时实现对复杂脂质极性及非极性成分的分离，在进行脂质组学分析时，结合使用PURSPEC Ω Analyzer 进行PB衍生化后的脂质样品，并后端串接Waters QTof 质谱系统，可精准分析复杂脂质体系中包括极性和非极性脂质成分，包括C=C双键的定位，为脂质组学工作者提供了一个高效快速的分析平台。