【领读】Nature Communications：《RNAi筛选揭示EV71复制关键因子》

2020-04-27 18:37:42, 小肚子美谷分子仪器（上海）有限公司

【领读】专栏第三弹！

本文字数：3120 字

阅读时间：10 分钟

本期文献介绍

标题：

《RNAi筛选揭示EV71复制关键因子》

发表平台：

Nature Communications

发表时间：17 October 2016

综述

肠病毒 71 型（EV71）是一种无抗病毒药物和疫苗的嗜神经型肠病毒，其宿主与病原体之间的相互作用尚不清楚。

本文使用全基因组的 RNAi 筛选识别出 256 个参与 EV71 在人类横纹肌肉瘤细胞复制的宿主因子。通过正交实验，确定所选因素在细胞周期调节和内质网相关降解中的作用。

本文证实了在 EV71 感染细胞中 CDK6 和 AURKB 为限制性因子；NGLY1 在内质网与 EV71 复制复合体共同定位，协助 EV71 的复制。我们证实了这些因素对人神经细胞系 EV71 复制和柯萨奇病毒 A16 感染的重要性。一种小分子 NGLY1 抑制剂可以减少 EV71 病毒的复制。本研究提供了 EV71 宿主因子的综合图谱，并揭示了潜在的抗病毒靶点。

太长不看版

肠病毒 71（EV71）是引起儿童手足口病的主要病毒之一，属于自限性疾病，目前尚无抗病毒药物或疫苗，严重者会导致死亡或引起长期神经后遗症，危害极大。
本文使用了横纹肌肉瘤细胞 (RD) 中 21,121 个人类基因的全基因组 siRNA 文库进行了免疫荧光表型筛选，筛选识别了参与 EV71 复制的 256 个宿主因子。
其中有两种激酶 CDK6 和 AURKB 是 EV71 的限制性因子（HRFs），另外有两种内质网降解（ERAD）途径相关的蛋白酶 NGLY1 和 VCP 是 EV71 的易感因子（HSFs）。
特定的细胞周期也会对病毒的感染及复制效率具有促进作用。
与囊泡运输相关的蛋白RDX是EV71病毒重要的宿主因子，在基因敲除实验中表明其可能起着促进EV71病毒进入和/或复制的作用。

专家导读

Molecular Devices

在显微成像领域有着7年的丰富经验，熟悉各类荧光、共聚焦、双光子显微镜和高内涵等成像设备。

本文的整体研究思路是这样的：

其中有三个主要的研究方法在整个研究中贯穿全文，这三种方法也是高内涵应用中非常经典的应用案例，分别是：

RNAi 文库筛选（蛋白质定量分析）
病毒感染率测定（阳性分析）

蛋白质定量和病毒感染阳性分析都可以在图像基础上，使用 MetaXpress 软件中的 Multiwavelength Cell Scoring 模块进行，在细胞免疫染色的基础上，可以得出感兴趣的目标蛋白（如病毒复制相关蛋白）的阳性率，以及每种蛋白质的定量结果（即该蛋白的荧光强度）

图1：Multiwavelength Cell Scoring

3.细胞周期对病毒感染敏感性测定（细胞周期分析）

图2：Cell Cycle

肠病毒 71 型（EV71）于 1969 年首次从加利福尼亚的中枢神经系统病人身上分离出来。从那时起，EV71 病毒再次成为影响全球 2-4 百万人口的手足口病（HFMD）暴发的原因之一。

肠病毒疾病流行发生于每年的夏、秋二季，易感染 15 岁以下儿童，感染后会有 2～10 天的潜伏期，可经由呼吸道的飞沫传染或经由胃肠道的粪便传染。

EV 71 对于中枢神经系统有极高的感染性，临床上出现症状包括脑炎（encephalitis）、无菌性脑膜炎（aseptic meningitis）、急性无力肢体麻痹（acute flaccid paralysis）、手足口症（hand - foot - mouth disease）、疱疹性咽峡炎（herpangina）、急性出血性结膜炎（acute hemorrhagic conjuctivitis）、肌肉僵直（myoclonic jerk）、头痛（headache）、发烧（fever）及呕吐（vomiting）等，而其中以手足口症及泡疹性咽峡炎最为常见。

所以 EV71 引起的疾病常被称作手足口病。另一种人类肠道病毒中，与 EV71 在系统上最接近的柯萨奇病毒（CA16），也能引起类似症状。

图3：Human Enterovirus 71 （EV71）和 coxsackievirus A16 (CA16)

图4：手足口病

本文通过对横纹肌肉瘤细胞 (RD) 中 21,121 个人类基因的全基因组siRNA文库进行了免疫荧光表型筛选，以识别促进（宿主易感性因子，HSFs）或抑制（宿主抗性因子，HRFs）EV71 复制的细胞因子。筛选识别出了参与 EV71 复制的 256 个宿主因子。

图5：RD细胞全基因组siRNA筛选流程

全基因组 siRNA 文库由每个基因(siGENOME, ThermoScientific)对应 4 个 siRNA 组成，排列在一系列 384 孔板中。其中包括实验组 siRNA 池与空白对照组 siRNA 池。

基因敲除是由反转染 RD 细胞与每一个 siRNA 载体和孵化 72 h 之后，然后将感染细胞固定，对 EV71 结构蛋白、VP0/VP2 以及细胞核进行免疫染色。通过自动显微镜获取图像，然后图像分析给出基于病毒抗原表达为阳性的细胞数量和细胞总数的结果（图 6）。

图6：对EV71和CA16与病毒感染相关的基因位点分析

细胞增殖基因控制 EV71 的复制。在整个验证筛选中研究者继续挑选了几种增殖和细胞周期控制基因作为首选。在评估的 16 个基因中，有 5 个基因参与了细胞增殖或生长因子信号通路(CDK6、AURKB、CIZ1、DTX1、TGFb1I1；图 7)。

图7：基因敲除后病毒感染细胞的示例图，其中绿色荧光标记病毒结构蛋白VP0/VP2，蓝色荧光标记细胞核

为了证实 CDK6 和 AURKB 在限制 EV71 感染中的作用，文中使用稳定过表达 CDK6、 AURKB 及其激酶非活性突变体的 RD 细胞群。

过表达 CDK6 的细胞仍然可以支持 EV71 感染，但与仅表达载体的细胞相比，其比例显著降低了 40% ，而激酶不活跃的突变体 D166N (CDK6 DN)并没有导致病毒感染的大量减少(图8b)。

这些结果表明，CDK6 活性可以限制 EV71 的复制。使用免疫荧光法追踪内源性 CDK6 在 EV71 感染后的细胞定位，发现在 EV71 感染后期，细胞核内 CDK6 转移至细胞质 (图8c)。

这些观察结果可能代表了 EV71 调节 HRF 促进自身感染的机制。然而，AURKB 的过表达并没有对 EV71 的复制产生任何负面影响。相反，过表达激酶沉默突变体（K106R, AURKB DN）导致 EV71 感染细胞减少 80%。

图8：CDK6 和 AURKB 两种激酶对病毒感染的影响分析

接着研究者利用碘化丙啶(PI)染色的细胞进行了细胞周期分析。过量表达 CDK6 和 AURKB 的稳定细胞系均与空载体表达细胞系（V5）进行对比（图9）。

图9：病毒感染过程中的细胞周期分析

为验证这些发现，文中使用了无血清处理和小分子抑制剂来抑制 RD 细胞的细胞周期阶段，并评估了它们对 EV71 感染能力的影响。实验通过在不同细胞周期进行血清剥夺实验，以及用特定药物抑制某一特定细胞分裂时期，评估哪个时期对病毒复制最为关键，然后利用小分子抑制剂进行某一分裂时期的抑制做为对照进行重复验证。

这些结果表明 EV71 的复制在非增殖细胞中受到限制，但在分裂细胞的特定细胞周期阶段（CDK6 的 G1/S 和 AURKB 的 G2/M，图10f）得到增强。

图10：细胞周期对病毒复制的影响

ERAD 组件是 EV71 复制所必需的。ERAD 是一种细胞质量控制过程，它将错误折叠的蛋白质从内质网中清除到细胞质中进行蛋白酶体降解。n-聚糖酶（nglycanase, NGLY1）是一种细胞质蛋白，通过与内质网蛋白 Derlin-1 (DER1)的相互作用，被富集到内质网表面，在蛋白酶体加载和降解之前，从易位蛋白中去除 n-连接的聚糖。

siRNA 敲除 NGLY1 可以抑制 RD 和 SK-N-SH 细胞中 EV71 的感染，也可以抑制 RD 细胞中 CA16 的复制（图7）。通过使用 NGLY1 抑制剂 Z-VAD-fmk 来验证这些发现，Z-VAD-fmk 对 EV71 感染有显著的剂量依赖性抑制作用。这些结果表明，NGLY1 对 ER 的补充及其聚糖酶活性对 EV71 感染至关重要。

事实上，我们观察到，在 ev71 感染的 RD 细胞中，NGLY1 在富含双链 RNA (dsRNA) 的囊泡中有明显的积累，这表明 NGLY1 在病毒诱导的复制囊泡中发挥了功能（图11e）。

图11：病毒颗粒与NGLY、VCP的共定位分析

VCP 在蛋白酶体降解的ER蛋白的逆转录转运中起作用，也被鉴定与 NGLY1 相互作用（图10a）。研究者发现 VCP 的 ATP 酶活性对 EV71 的复制至关重要。使用其可逆抑制剂 DBeQ 抑制 VCP 可显著减少 EV71 感染细胞（图12c）。

相反，过表达 VCP 不会影响EV71的复制。与 NGLY1 和 dsRNA 观察到的共定位相比，在 EV71 感染细胞中，VCP 斑点状小泡聚集在 dsRNA 病毒诱导的囊泡附近（图11f）。这一发现将 VCP 的作用扩展到与 EV71 感染相关，并增加了在 EV71 感染中的 ER 应激反应，包括 NGLY1。

图12：NGLY与VCP对病毒感染过程的相关性分析

此外，在筛选中还鉴定出的几个有特异性的位点，因为对它们基因敲除后对 EV71 的复制有影响。其中一个位点表达的是radixin （RDX），它是一种胞质、与放线菌素相互作用的蛋白，在主筛检中被鉴定为HSF，它可以与细胞骨架交联，在调节细胞形态、信号传递、膜转运甚至细胞分裂等方面发挥多种作用。

RDX 敲除可显著抑制 RD 和 SK-N-SH 细胞的 EV71 感染。在 CA16 感染中也观察到类似的抑制作用（图5）。虽然在 EV71 感染的细胞中大部分 RDX 保留了细胞外周的分布，但也可以观察到 RDX 的核周部分（图13b）。野生型 RDX 在 RD 细胞中过表达导致 EV71 的感染率略有上升（~20%），而缺乏多脯氨酸区域的突变型 RDX 过表达（RDX DP）导致 EV71 感染细胞显著减少（图13a）。

我们的研究结果显示 RDX 是 EV71 病毒重要的宿主因子，可能起着促进 EV71 病毒进入和/或复制的作用，并且在 EV71 病毒感染过程中通过重新定位进行调节。