我到底该如何待你——蛋白质组学的重复设置？

经常有老师会问，我能不能不设置生物学重复，能不能只进行技术重复？或者直接问能不能不设置重复？这个问题很难明确回答，我先在这里内心平静一分钟……因为有太多的“肺腑之言”需要宣泄了……

设计一个严谨的实验并且在实验样本数量允许的情况下，我想没有一位科研工作者可以否认生物学重复的重要性。但偏偏您还能拿出一篇某大牛发的高分文献出来：“你看，人家就没有设置重复啊，也能发文章呢？！”我能说什么呢？只能点头微微一笑，不肯定也不否定。其实内心撕心裂肺：“老师，人家是大牛啊！大牛啊！而且也不要只注意到人家的实验重复啊，要看看人家总体的一个设计思路啊！”

还有老师会对生物学重复、技术重复的定义产生不确定，不知道如何定义这些重复（好像重复的种类是有点多哈！没办法，我们需要学术严谨嘛）？我们翻阅了一些文献，暂时还没有找到一个权威公认的标准。我们推荐一篇文献，里面对实验中各种重复给出了比较务实的定义。

实验设计——无论对于实验结果的重复性，还是对于最终实验结论的可靠性，都起着起决定性的作用，亦是投稿时审稿人审评的要点。在大规模蛋白质组检测项目中，实验重复的设计至关重要。目前来说，重复类型主要有三类：生物学重复（technical replicates）、技术重复（biological replicates）和混合重复（pooled replicates）。

生物学重复：指对同一个组别中独立来源的重复样本分别进行独立分析，是整个实验的完全重复，如将具有同一基因型、不同批次培养的细胞株进行独立地测定。由于遗传和环境等因素的影响会引起有机体的个体差异，因此需要采用生物重复的实验设计方法来消除及反应该差异 ^[1]。不同类型样本材料的生物学重复要求次数不同，在未进行任何检测之前，通常只能根据前期基础或经验进行评估。一般普遍接受的生物学重复样本数为三次，如培养的细胞样本；而对于成对的动物或临床样本，则通常需要更多的生物学重复来减少个体化差异的影响。常规的蛋白质组学分析，如Label free、iTRAQ、DIGE等实验，目前都以3次或以上的生物学重复实验设计为主。

技术重复：指对同一样本进行重复地检测分析，例如，同一份细胞中抽提的蛋白质进行三次质谱检测；或者在iTRAQ实验中对同一个样本经酶解得到的肽段，采用不同的iTRAQ标签标记（即标记重复）。与生物学重复相比，技术重复的测量变异程度较小，从而可以减少实验中的分析变异，将对同一份样本产生高重复性的测量结果 ^[1]。技术重复通常适用于技术本身的稳定性和重复性并不十分理想的技术方法，如2D实验，进而可以减小技术本身的误差对实验结果的影响。

混合重复：指将同一组内的多个独立生物学样本进行混合，然后以混合样的形式进行分析。受限于蛋白质组学技术对样本量的要求和高昂的分析成本的限制，当独立的生物学重复样本的蛋白量过少时，或者为了减少个体化差异而需要分析大量的组内生物学重复样本时，通常普遍采用并且被认可的做法是将大量的生物学重复样本进行组内混合。混合方式通常有两种：第一种是将组内所有样本全部混合为一份混合样，对该混合样进行质谱或iTRAQ标记重复，该设计特点偏重于技术重复；第二种为将全部组内样本预先随机分为几个份，每份混合样再作为独立的生物学样本分别进行分析，此设计偏重于生物学重复，通常是较为推荐的设计（如，同一组内的30例动物样本，先随机将每10例样本进行混合，由此得到3份混合样，再对每份混合样进行独立分析）。混合重复的优点是：1. 可通过将多个样本混合来提高样本量，以满足技术对样本量的要求，如植物组织、昆虫等单个个体的样本量较少的样本，通常来自于相同条件下收集的多个个体样本的混合；2. 降低生物个体的个体化差异，如来自于动物或临床的独立样本的分析结果通常表现出较大的组内偏差，通过组内混合方式可以尽可能减小组内变异对数据分析的影响；3. 无需对每个个体样本都一一进行高昂的组学分析，从而可有效控制实验成本。

概况来说，生物学重复用于规律性生物学结论的揭示，技术重复用于减少分析技术造成的变异性。同时采用生物学重复与技术重复可以使得实验设计更加严谨，实验结果更加可靠。对于低样本量或个体化差异较大的样本，则适合采用混合重复。一般来说，实验重复都需要进行三次以上，这也是蛋白质组通常采用的T test等统计学方法的基本要求。

随着定量蛋白质组学技术的不断发展，得到的数据规模越来越大。一般首先可以通过生物信息学方法整理、归纳和挖掘有意义的数据信息，然后结合其他实验方法有针对性的进行目标蛋白质的定量结果验证和功能分析。对于前期蛋白质组学实验设计时因为经费或者样本量少而没有进行足够的生物学重复或者技术重复设计的结果，后期需要采取更多层面的、多角度的技术方法验证。针对运用蛋白质组学方法筛选临床诊断Biomarker的研究，在采取少量临床样本群体筛选出可能的Biomarker后，还需要进一步扩大样本量来验证和评价Biomarker的灵敏度和特异性。

目前蛋白质组学领域主流的杂志MCP (Molecular & Cellular Proteomics)，JPR (Journal of Proteome research)，Proteomics，JP (Journal of Proteomics)等对于大规模蛋白质组学数据的严谨性都有非常高的要求，并且都要求在正文或者补充数据中写明实验设计以及数据分析的细节（具体见下述杂志投稿须知链接内容）。对于没有进行合理的实验设计或重复次数的稿件，往往都会遭遇Major revision甚至rejection.。需要注意的是，对于组学的大规模分析，一旦需要后期再补充实验重复，后续补充的结果往往与前期结果无法完全一样，难以进行两批结果的直接整合。通常来说，后续的验证实验往往可以作为前期组学结果的有力支撑，然而我们也可能会遇到一些审稿人对于前期组学设计的合理性有着严苛的要求，而且个别结果的后续验证并无法完全反映整个组学实验的合理性。因此，常规的分析都建议至少采取三次生物学重复（2D实验则以将生物学混合后进行技术重复为主），并根据样本类型、实验目的等要求相应增加重复数量，以满足数据可靠性和文章发表的要求。

各大主流蛋白质组学杂志投稿须知具体如下：

ü MCP (Molecular & Cellular Proteomics) IF2014=7.254

Tutorial on Complying with the Protein Identification Guidelines:

http://www.mcponline.org/site/misc/Tutorial_MCP_final.pdf

Guidelines for the publication of glycomic studies:

http://www.mcponline.org/site/misc/glycomic.xhtml

Guidelines for Preparing Manuscripts Describing Research in Clinical Proteomics:

http://www.mcponline.org/site/cpmeeting/ProGuideIntro2.xhtml

Revised Publication Guidelines for Documenting the Identification and Quantification of Peptides, Proteins, and Post Translational Modifications by Mass Spectrometry:

http://www.mcponline.org/site/misc/PhialdelphiaGuidelinesFINALDRAFT.pdf

关于实验重复，MCP guidelines的原文描述为：

“• Indicate how biological and analytical reproducibility were addressed by experimental design.

• In order to determine whether a change is biologically significant, either the experiment must be repeated with multiple biological preparations, or the change must be independently confirmed by another means; e.g. a quantitative Western blot.”

作为蛋白质组学专业领域的头号杂志，虽然MCP在guidelines中对实验重复要求的描述比较简要，而且可以接受后期验证结果作为补偿，但实际上MCP的编辑和审稿人通常非常看重实验设计的合理性。一般来说，只有那些仅将组学的部分结果作为前期基础，而将后续功能与机制研究作为主体的文章，才有可能在组学设计并不十分完美的情况下顺利通过（毕竟，相比于其他组学专业杂志，MCP会更多一些偏重molecular）。

ü JPR (Journal of Proteome research) IF2014=5.001

Publication Guidelines for the Analysis and Documentation of Peptide and Protein Identifications:

http://pubs.acs.org/paragonplus/submission/jprobs/jprobs_proteomics_guidelines.pdf

关于实验重复，JPR guidelines的原文描述为：

“The experimental design and data analysis methods should be described in sufficient detail to enable critical assessment of the reliability of the results and conclusions.

• The methods for how the biological reliability of measurements was validated using biological replicates, statistical methods, independent experiments, etc.

• The methods for how the analytical reliability of measurements was validated using technical replicates and statistical methods

The absence of thorough validation of both analytical and biological results, including error analysis should result in rejection.“

可以看出，JPR对实验设计要求的相关描述比MCP更加详尽。一般可以认为，对于没有进行生物学重复实验的稿件，在JPR编辑手里的命运大多是被拒稿。

ü JP (Journal of proteomics) IF2014=3.929

Author information pack:

http://www.elsevier.com/wps/find/journaldescription.cws_home/713351?generatepdf=true

关于实验重复，JP guidelines的原文描述为：

“The experimental design must be provided and must include details of the number of biological and analytical replicates. Only one biological/analytical replicate will not be acceptable.

可以说Proteomics对实验重复要求的描述是最简要，也是要求最低的。但guidelines中也非常明确地指出，没有重复数据的结果是不被接受的。对于广大投稿者而言，如果是属于因各种客观条件的限制而未能进行生物学重复的稿件，可以尝试投向JP。

ü Proteomics IF2014=3.973

Instructions to authors:

http://onlinelibrary.wiley.com/store/10.1002/(ISSN)1615-9861/asset/homepages/2120_Instructions_to_authors_09_10.pdf?v=1&s=a2a426a9d75ae11a4da0a681abd61518c3136849&isAguDoi=false

关于实验重复，guidelines的原文描述为：

“The experimental design must be provided and must include details of the number of biological replicates. Only one biological replicate is not acceptable, even for cell line-based studies.

• The design of the analysis process should be described, for example, technical and biological replicate number, method and type of randomization, technical controls used, time span of sample analysis and whether undertaken with the operator blinded to sample status.

• For label and label-free methods the authors should include technical controls and state the number of technical replicates and also false positive rates.”

Proteomics对于实验设计的要求和标准的描述是最严格的，明确说明没有生物学重复的稿件不被接受，甚至要求进行技术重复以判断实验过程的可靠性。但实际上，Proteomics对实验重复的要求与JP相近，并没有MCP和JPR严格，对于一些相对冷门的研究领域，Proteomics也接受将生物学重复全混合后仅进行技术重复的实验设计。

最后，对于非蛋白质组学专业领域的杂志，尤其是不同的审稿人，基于他们对组学认识的不同，其对组学实验重复设计的要求是千差万别的，所以还是建议大家尽量在组学分析时进行比较完整的实验重复，以避免后续风险。

参考文献：

[1] Karp NA, Spencer M, et al. Impact of Replicate Types on Proteomic Expression Analysis. J Proteome Res. 2005, 4(5): 1867-1871.

中科新生命整理编译，欢迎转载！