最新Science重磅：磷酸化组学揭秘阿片类药物副作用潜在机制

2020-04-08 15:47:02, APTBIO-XWJ 上海中科新生命生物科技有限公司

相信这段时间，大家朋友圈都被电影《我不是药神》刷屏了吧，然而，大家却不一定知道，片中天价药物的真实原型格列卫，其研究史接近半个世纪，凝聚了几代科学家的心血，才最终获得药效好、靶向性高、副作用少等惊人效果。实际上，一款药物从研发到上市困难重重，期间通常伴随药物的多次改进。而对于靶向药物来说，靶向精准、无副作用大概是药物研发人员梦寐以求的结果，当然，并不是所有靶向药物最终都能达到这一标准。

电影《我不是药神》海报

片中天价药物的真实原型格列卫

G阿片类药物是作用于大脑中的强效止痛药，它是以kappa阿片受体（kappa opioid receptor，KOR）为药物靶标的药物，然而，它一直存在有害的副作用，如厌恶、焦虑等。至今为止，该药物的副作用机制也没有很好的解释和相应的治疗策略。2018年6月22日，来自德国马克斯-普朗克生物化学研究所（MPIB）等多个研究机构人员在国际顶级杂志Science发表文章，题为“In vivo brain GPCR signalingelucidated by phosphoproteomics”。在该研究中，研究人员利用高通量磷酸化蛋白质组学对KOR激动剂诱导的信号通路进行了深度解析并找到了其诱导厌恶副作用的靶点。

G蛋白偶联受体（GPCR）超家族是神经类疾病的主要药物靶标，但即使刺激单一的GPCR通常也会激活许多平行的信号通路，因此以GPCR为靶向的激动剂药物通常或多或少会产生副作用。比如，激活一个单一的GPCR---kappa阿片受体（kappa opioid receptor，KOR），会产生镇痛、抗惊厥等疗效，但同时会诱发焦虑、厌恶等副作用（图1）。本文中，研究人员利用不同KOR激动剂处理小鼠，取不同区域的脑部组织进行定量磷酸化蛋白组的测定，以寻找KOR激活的各信号通路中蛋白磷酸化修饰变化，最终揭示了阿片类药物副作用的潜在机制。

图1. KOR信号通路激活具有镇痛效果但伴随了副反应。

研究思路

研究结果

1.样本选择

首先，研究人员使用了5种不同结构的KOR激动剂注射小鼠（图.2.A），在注射后5分钟、30分钟后，分别提取小鼠大脑5个区域组织进行磷酸化定量分析（图.2.B），随后，利用自主研发的EasyPhos技术分别对各区域组织进行了磷酸化修饰组的定量分析，EasyPhos可同时在96孔板中对不同种类的细胞或组织的磷酸化蛋白质组进行高通量分析。

图2.实验设计流程。

（A）分别给予小鼠注射5种不同KOR激动剂（U-50,488H、HS665、RB64、 6′GNTI、 HS666）（B）激动剂注射后5分钟、10分钟，分别取小鼠大脑的5个不同区域（纹状体、海马、皮质、延髓和小脑）进行磷酸化修饰组测定。

2.获得差异数据

最终，实验鉴定到了6766个脑蛋白中大于50000个磷酸化位点的定量（图3.A、B）。进一部分析表明，不同的KOR激动剂对这些磷酸化位点的扰动程度并不一样，其中，激动剂U-50,488H对磷酸化位点扰动最大，注射U-50,488H激动剂5分钟后，纹状体即有超过1000个磷酸化位点发生变化（图3.C），因此，研究团队接下来主要对该激动剂处理的修饰变化进行深度分析。

图3.高通量磷酸化组测定KOR介导的GPCR信号通路。

（A）在定量到的超过50000个磷酸化位点中，U-50, 488H处理引起磷酸化位点扰动数目小于5%。（B）全磷酸化组鉴定结果。（C）U-50,488H处理5分钟对大脑不同区域的磷酸化位点扰动程度不一致。

3.筛选差异蛋白&验证

3.1非激动剂处理的各脑区磷酸化修饰分析

由于实验设计中引入较多影响因素，因此研究人员则通过逐步引入影响因素分析结果。首先，研究人员分析了非激动剂处理下各脑区的磷酸化修饰情况。主成分分析表明（图4.A），各脑区的蛋白磷酸化修饰呈现独特的区域性特征。结合以往研究（图4.B），分析还发现激酶的表达水平（激酶组）与相应的磷酸化肽段丰度呈显著相关性。

图4.非刺激的各脑区磷酸化修饰差异。

（A）各脑区磷酸化修饰的主成分分析。（B）激酶水平与相应磷酸化修饰肽段的相关性。

3.2脑不同区域的磷酸化（激动剂刺激）修饰差异比较&验证

随后，研究人员引入了KOR激动剂(U-50,488H)刺激这一因素对各脑区的磷酸化修饰差异进行分析。分析结果表明（图5.A、B），U-50,488H处理后，各脑区的蛋白质磷酸化修饰不仅呈现出区域特异性，而且表现出时间动态性。进一步聚焦至已知功能的磷酸化位点上，研究人员发现一些激酶和去磷酸化酶等磷酸化发生变化并进行了生化验证。

图5.U-50,488H刺激的各脑区磷酸化修饰差异。

（A） U-50,488H刺激后5分钟，各脑区磷酸化修饰的主成分分析。（B）U-50,488H刺激后30分钟，各脑区磷酸化修饰的主成分分析。（C）纹状体特异性U-50,488H信号的散点图。

3.3.脑纹状体区中突触蛋白的磷酸化分析&验证

根据差异筛选，研究人员发现已知的“神经递质分泌”、“受体内化调节”等通路磷酸化修饰扰动较大。鉴于副作用厌恶状态的出现是由于纹状体区域伏核内的棘突神经元被激活，因此作者接下来着重关注给予KOR激动剂处理后纹状体区域内突触蛋白磷酸化水平差异。作者通过对U-50,488H刺激5分钟后纹状体突触蛋白磷酸化水平的差异分析发现，突触蛋白被大规模去磷酸化，于是作者猜测U-50,488H可能特异性激活了磷酸酶系统。

图5.激动剂处理5分钟后，KOR介导突触信号通路中磷酸化修饰蛋白变化。

为了验证这一假设，作者给先给予小的鼠3类不同功能的磷酸酶抑制剂（Tauto、Fost、Caly）后，再给予小鼠U-50,488H处理，结果发现U-50,488H诱导的突触蛋白广泛去磷酸化现象消失（图6.A.B），该验证充分说明磷酸酶在突触GPCR信号转导中的重要性。

图6.磷酸酶PP2A介导了U-50,488H诱导的去磷酸化现象。

(A)50,488H诱导的PP2A底物磷酸化变化聚类热图。Tauto, PP1特异性抑制剂tautomycetin; Fost, PP2A抑制剂fostriecin; Caly, PP1和PP2A联合抑制剂; Saline, 负对照盐水（B）从(A)中选择性挑选磷酸化底物展示。

3.4脑纹状体区中mTOR通路的磷酸化分析&验证

通过对磷酸化差异信号通路的分析，研究人员发现在U-50,488H处理后5分钟，纹状体内mTOR信号通路被显著激活（图7.A），而以往的研究也发现纹状体内mTOR信号通路功能障碍跟重度抑郁相关，以上分析提示，KOR激动剂U-50,488H诱导的厌恶副作用可能是通过激活mTOR通路引起的。为了验证该假设，研究人员先给予小鼠mTOR信号通路抑制剂（temsirolimus, TEM）处理1h后再给予U-50,488H处理，结果发现小鼠动物模型的厌恶副作用消失，而其镇痛、抗惊厥疗效并不受影响（图7.B）。

图7.阻断mTOR信号传导抑制厌恶副反应，但不影响镇痛疗效。

(A)仅由U-50,488H和HS665介导的KOR活化5分钟后，纹状体中发生修饰位点显著差异的信号通路。（B）mTOR抑制剂不影响抗惊厥作用且消除了U-50,488H的厌恶副作用。Saline,负对照-生理盐水；vehicle,负对照-抑制剂溶剂+生理盐水；TEM,实验组-mTOR抑制剂+抑制剂溶剂+生理盐水

4.结论

磷酸化修饰组揭示了小鼠不同脑区的磷酸化蛋白具有区域特异性和时间动态性，此外，通过差异蛋白筛选，发现了突触通路蛋白磷酸化修饰的重要性。更重要的是，研究发现了mTOR通路是引起U-50,488H激动剂的厌恶副作用原因。

小编总结

本研究利用磷酸化修饰组学，研究不同KOR激动剂处理、不同时间、不同脑区的蛋白磷酸化修饰变化。虽然只利用单一磷酸化修饰组学技术，但实验设置了多个影响因素，获得了高通量的磷酸化修饰信息。因此，如何层层递进的分析实验数据成为了极为关键的步骤。

首先，研究人员分析了不受刺激状态下各脑区的磷酸化修饰差异，发现区域特异性特征。其次，研究人员分析了激动剂刺激后各脑区的磷酸化修饰变化，发现了激动剂激活的区域特异性、时间动态性。根据磷酸化扰动情况，研究人员选择了U-50,488H激动剂注射后，5分钟的脑纹状体进行深入分析。随后，在纹状体中深入分析突触信号通路，发现激动剂处理的去磷酸化现象。利用磷酸酶抑制剂作为验证，证实了磷酸酶在其中的重要作用。最终，研究人员关注到纹状体中mTOR信号通路修饰差异，结合mTOR功能和后续验证，研究发现了U-50,488H引起厌恶副作用的机制—mTOR信号通路。

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