药典标准丨基于 Biacore 技术的双特异性抗体检测

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基于Biacore技术的双特异性抗体检测

双特异性抗体可同时特异性结合 2 个抗原或抗原表位，从而达到同时阻断 2 个抗原/表位介导的生物功能，或将表达 2 种抗原的细胞拉近而增强其相互作用的目的。其双特异特性有着巨大的应用优势，如通过同时靶向肿瘤和免疫细胞达到召集免疫细胞清除肿瘤细胞的目的，还可以拮抗 2 种信号传导配体避免逃逸。

目前，近百种双特异性抗体处于临床研究阶段，blinatumomab、Emicizumab 等双特异性抗体已经上市。

Biacore 作为中美日三国药典收录的分子互作技术，为国内外多家药企的双特异性抗体开发和上市提供了关键数据。

2017 年，FDA 批准了 Genetech 公司的双特异性抗体 Hemlibra 用于血友病治疗。Hemlibra 可以将激活天然凝血级联所需的蛋白质因子 IXa 和因子 X 聚集在一起，恢复血友病患者的凝血过程。对于双特异抗体来说，首先需要表征其两个 Fab 段与两个抗原结合位点的亲和力。在 Hemlibra 的申报材料中，Biacore 用于检测其与 hFIX 和 hFIXa 的结合，结果显示亲和力分别为 1.6uM 和 1.5uM。

2018 年，天广实在《Mabs》上发文，介绍了其双特异抗体 MBS301 的研究进展。MBS301 能同时结合 HER2 抗原的 D2 和 D4 结构域，从而起到帕妥珠和曲妥珠两个单抗药联用的效果。文中，作者通过 Biacore 技术证明了 MBS301 和 HER2 的亲和力与已上市单抗相当。

对于双特异抗体，还需要确认其能够同时结合两个抗原位点。该文中基于 Biacore 竞争实验思路，证实了 MBS301 能同时结合 D2 和 D4 两个结构域。

 1. T-mab 饱和抗原，进样 MBS301 仍然有结合。而用 MBS301 饱和抗原后，进样 T-mab 没信号，证实了 MBS301 与 T-mab 竞争结合 D4；

抗体与 Fcγ 受体的亲和力能够作为药物功效及半衰期的预测指标，因为其直接影响抗体的 ADCC/CDC 活性，因此 Fcγ受体的结合活性也是双特异性抗体的必检项。例如，阿斯利康基于 Bs4Ab 设计出的针对 VEGF/ANG-2 的双特异性抗体，用 Biacore 来阐明其与 anti-VEGF 和 anti-Ang2 单抗的 Fcγ 受体亲和相当。

在已经公开的文章中，作者首先介绍了 Biacore 在双特异性抗体研究中的独特实验设计，在一个实验中同时对双靶点抗原进行检测。将 VEGF 固定在芯片表面，之后结合 CrossMab 双抗，最后流过 Ang-2。VEGF 的结合信号由图中 R1 表示，Ang-2 的结合信号由 R2 表示。保持 VEGF 的偶联水平和 Ang-2 的进样浓度不变，进样不同浓度的 CrossMab，以 R2 vs 抗体浓度作出标准曲线。

随后，作者基于 USP1034 进行了平行线模型分析（Parallel Line Model）和斜率比模型分析（slope-ratio model），线性区间分别为 1.2-4ug/mL 和 0.5-1.8ug/mL。展示了 Biacore 符合美国药典 USP1034 对于双特异性抗体进行活性浓度定量的要求。

之后，作者对该方法进行了方法验证，结果显示 Biacore 技术进行活性浓度定量的线性相关度达到了 0.9997, 准确度达到了 97%，精密度达到了 2% 以内！这些都充分体现了 Biacore 出色的检测稳定性和重复性。