加速疫苗开发，液质分析技术渐显趋势

疫苗一直以来被认为是应对传染病最行之有效的手段之一，疫苗种类涉及活的减毒病原体（如病毒、细菌）、灭活的病原体、表达抗原的细胞、蛋白质、多肽、多糖，以及这些成分单独存在或与载体结合构成的疫苗，还包括重组病毒载体和重组质粒DNA制成的疫苗等[1]，具有天然的复杂性，开发和质量控制难度大。

近年来，液相色谱(LC)和液质联用技术(LC-MS)越来越多地应用于疫苗开发的不同阶段，如使用LC-MS准确测定蛋白完整质量数和氨基酸序列；使用LC-MS/MS鉴定目标蛋白、抗原鉴定、糖基化表征、蛋白截短和偶联以及其它翻译后修饰、宿主蛋白分析；使用定量质谱评估多种阶段产品的抗原含量（代表疫苗有效性）等方面，对疫苗的开发和质量控制发挥着重要作用。

LC用于流感疫苗效价测试

以流感疫苗为例，其有效成分为血凝素(HA)，WHO规程规定采用单向免疫扩散法(SRID)试验测定流感疫苗中HA含量，但该方法需依赖WHO每年分发的标准抗原参考品和标准血清，而制备这些标准品往往需要2~3个月的时间，SRID法所需的免疫学试剂通常要花费6-8周制备。在大流感爆发时，可能会影响疫苗的研发及上市，错过疫苗使用的最佳时机。

因此，WHO提出在大流感爆发初期，有必要建立替代方法来检测流感疫苗中HA的含量。研究者将样品处理后再进行反相色谱分离，测得的HA蛋白含量在多种流感疫苗中均与SRID法测得的效价对应的抗原数量相关性良好，液相色谱法可更好地阐释流感疫苗效价丧失的机理，可以更灵敏、区分有翻译后修饰的蛋白[2]。

图1. 某流感疫苗样品处理后的SDS-PAGE和RP-LC图谱

LC-MS技术用于流感疫苗中

血凝素上N-糖肽的分离与表征

经批准的季节性流感灭活疫苗通常含有规定量的HAs — H1、H3和B的混合物，对应3种最常见的病毒流感A亚型的H1N1和H3N2和流感B的HA蛋白。这些HA蛋白是糖蛋白类，每个糖基化位点均含有多种N-糖基化基序且每个位点含多种糖型。

沃特世科学家团队基于液质联用技术对重组流感疫苗中血凝素上N-糖肽进行了分离与表征，UPLC/MSE可区分并鉴定由昆虫细胞-杆状病毒重组表达系统(BEVS)表达的流感疫苗候选物HAs蛋白的N-糖基化[3]。由于HAs在流感结合至宿主细胞，即感染过程中的重要决定作用，HAs中糖基化的精细鉴定和监测对疫苗的开发和生产都非常重要。

图2.HA蛋白B中糖基化和未糖基化胰蛋白酶肽段T8的分离和鉴定

图3. HA蛋白H1中糖肽T24*的糖型的分离与鉴定

图4. HA蛋白H3中糖肽T21*糖型的分离和鉴定

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LC-MS技术用于疫苗的鉴别试验

鉴别试验是保障疫苗有效性的重要测试项目，通常用于制品的身份确认，例如某联合疫苗的鉴别试验，在其最终原液、半产品和成品阶段都必须经过包括琼脂免疫扩散法、SDS-PAGE/免疫印迹法、斑点印迹杂交法、3个酶联免疫吸附法等计6个鉴别测试项目，以确认每种蛋白抗原的存在，费时费力、且需要使用多种特制的、昂贵的抗体（制备时间长、须经检验合格、小心储存）。 

图5. 通过检测抗原特异性肽段鉴别蛋白抗原的LC-MS流程

采用LC-MS鉴别法，通过检测抗原的特异性肽段来鉴定蛋白抗原, 可以实现“6法合1”，不但大幅提高了效率、节省了成本，还大大降低了测试方法导致的疫苗失效比率。

✔ 可以鉴别所有该联合疫苗品种，每个产品都可以从其它相似疫苗产品中区分开来

✔ 一种方法可同时鉴别出9种蛋白抗原

✔ 通过抗原特异性肽段相对含量的对比，还可用于假冒疫苗的鉴别

为了更好地助力LC及LC-MS技术在疫苗开发中的运用，沃特世举办网络讲座与大家分享最新进展与案例，欢迎参加！

LC与LC-MS技术在疫苗开发和质量控制上的应用进展

 讲座时间

2020年3月25日，14:00 – 15:00

讲座概要

► 采用先进分析技术的工业驱动力

- 疫苗产品开发和制造的限制与复杂性

► LC与LC-MS在疫苗开发和质量控制中的应用

- Native MS用于蛋白复合物和组合体的分析

- 氢氘交换质谱（HDX-MS）用于疫苗抗原表位与补位的发现

- LC-MS用于抗原表征 — 理解疫苗的关键质量属性（如结构、含量、鉴别等）

- LC系统用于疫苗分析的考量

- 最新疫苗质量控制方法案例

主讲人

宋兰坤

沃特世制药市场高级经理

参考文献：

1.《疫苗的质量控制与评价》，王军志主编，人民卫生出版社出版（2013）

2．Wen, Y. et al. Conformationally selective biophysical assay for influenza vaccine potency determination. Vaccine 33, 5342–5349 (2015).

3． Hongwei Xie, Weibin Chen, Martin Gilar, St John Skilton, and Jeffery R. Mazzeo，Separation and Characterization of N-linked Glycopeptides on Hemagglutinins in a Recombinant Influenza Vaccine. Waters Application Note, 720003173en.