2020-03-17 15:38:03, Waters 沃特世科技(上海)有限公司
疫苗一直以来被认为是应对传染病最行之有效的手段之一,疫苗种类涉及活的减毒病原体(如病毒、细菌)、灭活的病原体、表达抗原的细胞、蛋白质、多肽、多糖,以及这些成分单独存在或与载体结合构成的疫苗,还包括重组病毒载体和重组质粒DNA制成的疫苗等[1],具有天然的复杂性,开发和质量控制难度大。
近年来,液相色谱(LC)和液质联用技术(LC-MS)越来越多地应用于疫苗开发的不同阶段,如使用LC-MS准确测定蛋白完整质量数和氨基酸序列;使用LC-MS/MS鉴定目标蛋白、抗原鉴定、糖基化表征、蛋白截短和偶联以及其它翻译后修饰、宿主蛋白分析;使用定量质谱评估多种阶段产品的抗原含量(代表疫苗有效性)等方面,对疫苗的开发和质量控制发挥着重要作用。
LC用于流感疫苗效价测试
以流感疫苗为例,其有效成分为血凝素(HA),WHO规程规定采用单向免疫扩散法(SRID)试验测定流感疫苗中HA含量,但该方法需依赖WHO每年分发的标准抗原参考品和标准血清,而制备这些标准品往往需要2~3个月的时间,SRID法所需的免疫学试剂通常要花费6-8周制备。在大流感爆发时,可能会影响疫苗的研发及上市,错过疫苗使用的最佳时机。
因此,WHO提出在大流感爆发初期,有必要建立替代方法来检测流感疫苗中HA的含量。研究者将样品处理后再进行反相色谱分离,测得的HA蛋白含量在多种流感疫苗中均与SRID法测得的效价对应的抗原数量相关性良好,液相色谱法可更好地阐释流感疫苗效价丧失的机理,可以更灵敏、区分有翻译后修饰的蛋白[2]。
图1. 某流感疫苗样品处理后的SDS-PAGE和RP-LC图谱
LC-MS技术用于流感疫苗中
血凝素上N-糖肽的分离与表征
经批准的季节性流感灭活疫苗通常含有规定量的HAs — H1、H3和B的混合物,对应3种最常见的病毒流感A亚型的H1N1和H3N2和流感B的HA蛋白。这些HA蛋白是糖蛋白类,每个糖基化位点均含有多种N-糖基化基序且每个位点含多种糖型。
沃特世科学家团队基于液质联用技术对重组流感疫苗中血凝素上N-糖肽进行了分离与表征,UPLC/MSE可区分并鉴定由昆虫细胞-杆状病毒重组表达系统(BEVS)表达的流感疫苗候选物HAs蛋白的N-糖基化[3]。由于HAs在流感结合至宿主细胞,即感染过程中的重要决定作用,HAs中糖基化的精细鉴定和监测对疫苗的开发和生产都非常重要。
图2.HA蛋白B中糖基化和未糖基化胰蛋白酶肽段T8的分离和鉴定
图3. HA蛋白H1中糖肽T24*的糖型的分离与鉴定
图4. HA蛋白H3中糖肽T21*糖型的分离和鉴定
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LC-MS技术用于疫苗的鉴别试验
鉴别试验是保障疫苗有效性的重要测试项目,通常用于制品的身份确认,例如某联合疫苗的鉴别试验,在其最终原液、半产品和成品阶段都必须经过包括琼脂免疫扩散法、SDS-PAGE/免疫印迹法、斑点印迹杂交法、3个酶联免疫吸附法等计6个鉴别测试项目,以确认每种蛋白抗原的存在,费时费力、且需要使用多种特制的、昂贵的抗体(制备时间长、须经检验合格、小心储存)。
图5. 通过检测抗原特异性肽段鉴别蛋白抗原的LC-MS流程
采用LC-MS鉴别法,通过检测抗原的特异性肽段来鉴定蛋白抗原, 可以实现“6法合1”,不但大幅提高了效率、节省了成本,还大大降低了测试方法导致的疫苗失效比率。
✔ 可以鉴别所有该联合疫苗品种,每个产品都可以从其它相似疫苗产品中区分开来
✔ 一种方法可同时鉴别出9种蛋白抗原
✔ 通过抗原特异性肽段相对含量的对比,还可用于假冒疫苗的鉴别
为了更好地助力LC及LC-MS技术在疫苗开发中的运用,沃特世举办网络讲座与大家分享最新进展与案例,欢迎参加!
LC与LC-MS技术在疫苗开发和质量控制上的应用进展
讲座时间
2020年3月25日,14:00 – 15:00
讲座概要
► 采用先进分析技术的工业驱动力
- 疫苗产品开发和制造的限制与复杂性
► LC与LC-MS在疫苗开发和质量控制中的应用
- Native MS用于蛋白复合物和组合体的分析
- 氢氘交换质谱(HDX-MS)用于疫苗抗原表位与补位的发现
- LC-MS用于抗原表征 — 理解疫苗的关键质量属性(如结构、含量、鉴别等)
- LC系统用于疫苗分析的考量
- 最新疫苗质量控制方法案例
主讲人
宋兰坤
沃特世制药市场高级经理
参考文献:
1.《疫苗的质量控制与评价》,王军志主编,人民卫生出版社出版(2013)
2.Wen, Y. et al. Conformationally selective biophysical assay for influenza vaccine potency determination. Vaccine 33, 5342–5349 (2015).
3. Hongwei Xie, Weibin Chen, Martin Gilar, St John Skilton, and Jeffery R. Mazzeo,Separation and Characterization of N-linked Glycopeptides on Hemagglutinins in a Recombinant Influenza Vaccine. Waters Application Note, 720003173en.
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