如何在完整蛋白水平分析时保证天然构象？HIC 了解下

2020-01-16 13:05:18, 消耗品应用团队安捷伦科技（中国）有限公司

众所周知，蛋白质的生物活性与其构象密切相关，有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失，造成蛋白质变性。因此，为了更好地表征蛋白天然状态下的结果，行业需要一种手段来补充说明完整蛋白保持在非变性状态下的情况。

疏水相互作用色谱（HIC）作为一种基于疏水性细微差异实现温和分离蛋白质异构体的重要技术手段，正越来越多的受到关注。

何为 HIC？

HIC 采用具有适度疏水性的填料，使用含盐流动相来降低生物分子溶解度，以便这些分子吸附到 HIC 固定相上。通过梯度洗脱逐渐减小盐浓度，使吸附在固定相上的生物分子按照疏水性逐渐增加的顺序洗脱。分离过程类似于反相色谱，但是整个过程无需使用通常会导致蛋白质变性的离子对试剂和高浓度有机溶剂组分，分离的柱温也通常比较温和。

HIC 的适用范围有哪些？

HIC 可用于表征来自翻译后修饰 (PTM) 的单克隆抗体（mAb）异构体。HIC 色谱柱可在不将 mAb 分解为亚基或不采用其它样品前处理方法的前提下分离被氧化的物质。暴露的氨基酸侧链残基（如甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸）的氧化是单克隆抗体的一种常见降解途径，也是生物技术中面临的一项主要分析挑战。通常，与天然形式相比，氧化的 mAb 效价会降低。因此，为确保 mAb 产品的疗效，对这些降解的分析至关重要。mAb 氨基酸残基的氧化会改变 mAb 的疏水性，这是由于氧化形式具有更高的极性或可引起构象的变化。因此，HIC 极为适用于此类样品的分析、表征。

此外， HIC 还非常适合于对半胱氨酸连接的抗体药物偶联物（ADC）的分析。ADC 这类复杂分子的疏水性通常会高于未修饰的抗体，HIC的温和洗脱条件又能确保ADC在分离过程中保持未变性状态，因此 HIC 非常适用于分离那些具有不同药物/抗体比率（DAR）的ADC。

什么是 HIC 的最佳搭档？

为完美应对蛋白质这类生物分子的分析挑战性，安捷伦特开发出了 450Å 孔径、3.5μm 的 AdvanceBio HIC 色谱柱。该色谱柱：

采用 ZORBAX 全多孔颗粒填料和专利键合填充技术：创新的疏水作用化学键合相经过严格优化，以确保色谱柱的最佳选择性，非常适合用于测定 mAb 氧化和 ADC DAR 比率
更高的稳定性：每批填料均采用 NIST mAb 标准品进行质量和可靠性测试，性能经得起考验
更高的分析效率：色谱柱更短，保持分离性能的同时可减少分析时间

图 1. AdvanceBio HIC 柱稳定的批次重现性以及可靠性

AdvanceBio HIC 色谱柱的应用表现如何？

以 ADC 的 DAR 分析应用为例，如下图实际样品的分离结果得到，AdvanceBio HIC 色谱柱可高分离度的分析具有不同 DAR 的 ADC，且其温和条件能确保 ADC 保持未变性状态。

由于，与 mAb 偶联的疏水性药物小分子的存在，导致 mAb 分子的总体疏水性发生显著改变，使得在该应用中向流动相中添加了一些有机改性剂，但仍保证了条件的温和（参见方法条件和梯度曲线部分）。

此外，在该应用中还对比探讨了两种不同柱长的 AdvanceBio HIC 色谱柱的分离效果，以便满足不同实验的需求。通过实验对比得到，用于常规分析的 100mm 色谱柱（AdvanceBio HIC, 4.6 × 100 mm, 450 Å, 3.5 μ，部件号：685975-908）和可更快获得结果的 30mm 色谱柱（ AdvanceBio HIC, 4.6 × 30 mm, 450 Å, 3.5 μm，部件号：681975-908），虽然分析速度差别巨大，但均可获得一致结果（DAR 4.4）。

图 2. 采用 AdvanceBio HIC 色谱柱分析 ADC 的实验条件和分析结果

还有哪些明星产品推荐？

HIC 中使用的高浓度盐意味着采用全生物惰性液相色谱（bio-inert LC）是非常有利的。如果在实验室没有 bio-inert LC 情况下，那么使用生物惰性备件（如 PEEK 内衬的不锈钢毛细管等）将更加有利于液相色谱系统或色谱柱的维护。即使如此，避免使液相色谱系统或色谱柱长期暴露于高浓度盐溶液中仍然很重要。