大咖讲堂 | 相干拉曼散射显微术 Ⅱ

2019-12-23 21:01:29, 季敏标徕卡显微系统(上海)贸易有限公司

“

上节我们讲到——相干拉曼散射（CRS）显微术是一种基于分子化学键振动的成像手段。相比于荧光光谱，拉曼光谱具有窄得多的谱峰宽度（图 1），可以选择探测的分子种类将更多，特异性也更高。例如，生物组织中的蛋白、脂质和核酸等具有各自的拉曼光谱特征，利用 CRS 可以在无需染色/标记的前提下对它们进行区分成像。

”

但脱离应用的理论就像浩渺星海中失去坐标的飞船，空得一身高强本领却无处发挥。因此，秉承上节所述的相干拉曼显微术的基本原理，本小节将围绕快速病理检测、生物代谢和药物运输三个典型方面详细展开免标记相干拉曼显微术的应用，为这艘“神州飞船”的前行指引明灯。

▲图 1. 常见生物组分和分子的拉曼光谱

快速病理检测：

病理检测是疾病诊断的金标准。现有的病理检测方法需要经过活检（或手术）取样、固定、切片、染色等一系列繁杂过程，往往耗时几天，无法实现术中实时诊断。术中冰冻往往也至少需要半个小时，而且诊断准确率不高。基于生物组织内源性光学信号的成像方法有望快速提供组织病理学信息，辅助术中诊断。

2013 年，季敏标教授在哈佛大学谢晓亮教授课题组学习期间利用 SRS 显微镜实现了在脑胶质瘤小鼠模型活体中原位实时地探测肿瘤边界^[1]，之后在离体人脑肿瘤手术标本中实现无标记病理诊断^[2]。归国后，季教授课题组在复旦大学搭建了结合了 SRS、SHG 和 TPEF 的多模态非线性光学成像系统，可同时获取脂质、蛋白、胶原纤维三个通道的图像。在近期一篇文章中，季教授不仅在喉癌组织切片层面展示了 SRS 和传统病理 HE 染色的高度一致性（图 2），并且通过对喉癌术中新鲜组织的成像，累计了数万份图像数据，最后基于搭建的 34 层残差卷积神经网络（ResNet34）进行图像训练识别，获得了近乎 100%准确率的肿瘤与正常组织的鉴别效果^[3] 。

由于 SRS 继承了自发拉曼的光谱特性，使其能够在高光谱扫描时得到重要的谱学信息。在对阿尔兹海默（AD）研究的过程中^[4] ，发现错误折叠的淀粉样蛋白会因为 β-sheet 的富集而导致 amide I 的拉曼峰蓝移（峰位从 1658 cm^-1变为 1670 cm^-1）；并且通过对新鲜 AD 鼠脑组织成像，观察到了每个 Aβ 斑块的周围都会有一圈“Halo”的特殊构象（图 3），这是荧光研究（只能对确定物质进行特异性染色）所难以发现的，充分体现了 SRS 在病理学检测上的独特优势。

▲图 2. SRS 与 HE 图像的一致性对比（绿：脂质；蓝：蛋白质；红：胶原纤维）[3]

▲图 3. 新鲜 AD 鼠脑的 SRS 光谱图像以及斑块、正常组织的光谱差异 [4]。（a-c）指纹区的光谱图像，绿：脂质；蓝：正常蛋白质；洋红：淀粉样蛋白斑块。（d-f）C-H 伸缩振动区的光谱图像，绿：脂质；洋红：总蛋白质。(g-h)不同组织区域的 SRS 光谱

生物代谢：

以高时空分辨率直接观察活体动物的代谢动力学对理解许多生物学过程至关重要。脂类分子是重要的生命组成物质，但定量地观察其空间分布一直是一个难题。使用荧光基团时，有可能产生假象，做出的判断有偏差。相比之下，SRS 可以对分子直接可视化，得到的结果具有普遍意义。

2018 年，哥伦比亚大学闵玮教授课题组发展了将重水（D2O）代谢与受激拉曼散射（DO-SRS）显微技术相结合的技术，用于原位代谢观测^[5] 。在生物代谢过程中，经过酶的催化合成，D2O 中的氘原子会被自动整合到有机分子中，形成同位素标记的 C-D 键。因此，基于对新合成有机分子中 C-D 键的成像，就可以实现生物代谢的追踪观测（视频 1）。目前，在 C-D 键的广泛振动光谱中，他们发现了脂质和蛋白质的特异性拉曼位移，并开发了光谱解调方法来获得具有大分子选择性的 C-D 信号，做到了在动物模型中脂质、蛋白甚至糖类的代谢测量^[6][7]。

▲视频 1.秀丽隐杆线虫的脂质 SRS 实时成像（左：原本存在的脂质；右：利用 D2O 新合成氘代脂质）[5]

药物运输：

在医药学中，药物的运输是学者们关注的重点之一，准确地运输过程及定位，是药物分子能实现特定生理功能的重要保障。制作小分子药物的荧光标签并非容易之事，常用的荧光标签往往比药物分子大很多，这会影响他们的运输特性；因此，利用传统荧光标记方法追踪小分子药物面临很多挑战。而很多药物分子本身具有特殊的化学键振动（图 4），因此，利用 SRS 可以对该药物进行很好的特异性成像，加之 SRS 不需要对样品固定、染色等操作，最大程度上保持了生物体样品的活性，可以实现系列活体动态捕捉。

2014 年，闵玮教授将疗霉舒乳膏涂抹于小鼠耳朵部位，通过对药膏中盐酸特比萘芬分子的炔基进行特异性成像，结合脂质和蛋白通道的共定位，发现了该药物是通过皮肤中脂质进行渗透的^[8]（图 5）。

同年，谢晓亮教授课题组报道了利用高光谱受激拉曼散射（hsSRS）成像技术对两种酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物（伊马替尼和尼洛替尼）在活细胞内的免标记成像以及定量分析^[9] 。他们发现，由于这两种药物具有溶酶体的亲溶性，它们在溶酶体中的浓度都增加了 1000 倍以上。当同时使用氯喹时，伊马替尼的溶酶体捕获减少了十倍以上，这表明氯喹除了常见的自噬抑制机制外，还可能通过溶酶体介导的药物相互作用提高 TKIs 的疗效。

▲图 4. 药物分子的结构式及其拉曼光谱 [9]

▲图 5.局部应用盐酸特比萘芬对小鼠耳部皮肤的 SRS 成像（2230cm^-1：盐酸特比萘芬；1655cm^-1：蛋白质；脂质 2845cm^-1：脂质）[8]

下一节我们还将聚焦 CRS 发展前沿，介绍 CRS 技术的最新进展。

参考文献：

1.Ji, M. et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Sci Transl Med 5, 201ra119,

doi:10.1126/scitranslmed.3005954 (2013)

2.Ji, M. et al. Detection of human brain tumor infiltration with quantitative stimulated Raman scattering microscopy. Sci Transl Med 7, 309ra163,

doi:10.1126/scitranslmed.aab0195 (2015).

3.Zhang, L. et al. Rapid histology of laryngeal squamous cell carcinoma with deep-learning based stimulated Raman scattering microscopy. Theranostics 9, 2541-2554,

doi:10.7150/thno.32655 (2019).

4.Ji, M. et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer''s disease with stimulated Raman scattering microscopy. Sci Adv 4, eaat7715,

doi:10.1126/sciadv.aat7715 (2018).

5.Shi, L. et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications 9, 2995,

doi:10.1038/s41467-018-05401-3 (2018)

6.Zhang, L. et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nat Biomed Eng 3, 402-413,

doi:10.1038/s41551-019-0393-4 (2019).

7.Shen, Y. et al. Metabolic activity induces membrane phase separation in endoplasmic reticulum. Proc Natl Acad Sci U S A 114, 13394-13399,

doi:10.1073/pnas.1712555114 (2017).

8.Wei, L. et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nat Methods 11, 410-412,

doi:10.1038/nmeth.2878 (2014).

9.Fu, D. et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nat Chem 6, 614-622,

doi:10.1038/nchem.1961 (2014).

（上下滑动查看所有参考文献）

作者简介

季敏标，男，1982 年出生于浙江省台州市。2001 年获北京大学物理系学士；2011 年获美国斯坦福大学物理系博士学位，研究方向为非线性光学和超快分子动力学；之后在哈佛大学谢晓亮组里从事博士后研究（2011-2014），发展相干拉曼成像技术并将其应用到肿瘤的无标记探测。2014 年入职复旦大学物理系担任研究员和博士生导师。2015 年入选中组部“千人计划”（青年组）和上海市“青年科技启明星计划”。

季教授的研究方向集中在非线性光谱学在物理、化学和生物医学等交叉学科中的应用，研究课题包括利用新型光谱显微成像技术研究生物医学问题，以及新材料的光电子特性研究等。迄今发表 SCI 论文 50 余篇，包括 Science, Science Translational Medicine, Science Advances, PNAS 等。并承担科技部重点研发计划“数字诊疗装备”青年专项、基金委面上项目、上海市科技创新行动计划等多项科研项目。

作为一款成熟的商品化 CRS 产品，徕卡 TCS SP8 CARS 共聚焦显微镜可以简单快速地实现 CARS 无标记成像、单光子/多光子共聚焦荧光成像、二次（SHG）/三次（THG）谐波成像，或者使用红外、紫外激光进行的各种应用的成像，满足全方位、多维度的高级生命科学研究需要。