【一点干货】泛素化和磷酸化的协同作用调控蛋白质的降解

真核生物的蛋白质在翻译后通常要进一步加工修饰，在细胞外信号的刺激下，参与信号转导的蛋白质受翻译后修饰的调节，如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、丙二酰化等，这些共价修饰是瞬时并可逆的，在调控蛋白质的功能中起重要作用。不同的翻译后修饰方式并不是单独发生的，它们可以组合在一起，相继或同时发生，从而增强蛋白质的生物学活性，大大扩展它们在信号通路中的功能。细胞内蛋白质泛素化是重要的翻译后修饰方式之一，细胞外信号严格调控着目的蛋白的泛素化，在很多情况下，这种调控依赖于蛋白质的磷酸化。蛋白质的泛素化和磷酸化协同作用，相辅相成，精确调控细胞内的信号转导通路。

泛素是一个保守的由76个氨基酸残基组成的多肽，广泛存在于真核细胞中。细胞内绝大多数蛋白质通过泛素依赖的蛋白酶体途径降解闭。对底物进行泛素化标记是启动特异性蛋白质降解的关键步骤，这个过程由泛素活化酶(E1)、泛素交联酶(E2)和泛素连接酶(E3)顺序催化完成。这3种酶在细胞中的数量分布呈金字塔型，在大多数真核细胞中只有1个E1、有限的E2(哺乳动物约60个)和最大数量的E3 。E3负责底物的识别，决定反应底物的特异性。真核细胞内主要有2类E3连接酶，即具HECT催化结构域的蛋白和具RING锌指结构域的蛋白。每个E3识别系列底物，并与一个或几个E2一起催化底物的泛素化。因此，对E3催化活性或E3-底物问相互作用的调控比对E2催化活性的调控具有更大的意义。多聚泛素化的底物蛋白质可迅速被26S蛋白酶体亚基识别和降解。泛素介导的蛋白质降解在很多基本的细胞生理过程中发挥重要的作用，这些过程包括细胞周期和分化、细胞应激反应、DNA修复、转录调控、免疫及炎症反应的调控等。

蛋白质的磷酸化是指由蛋白激酶催化的把ATP或GTP-γ位的磷酸基团转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程。细胞内蛋白激酶可以分为2大类，一类是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与多种信号转导过程；另一类是酪氨酸蛋白激酶，在细胞生长、分化和转化中起重要作用。蛋白激酶可以通过磷酸化调节蛋白质的活性，还可以通过蛋白质磷酸化的级联反应逐级放大信号，因此蛋白质磷酸化的调节在信号转导过程中有重要作用，是细胞生命活动的调控中心。

1. 底物蛋白质的磷酸化调控蛋白质经泛素蛋白酶体途径的降解

越来越多的研究发现，丝氨酸和苏氨酸的磷酸化可以使底物蛋白质迅速经泛素蛋白酶体途径降解，一种叫Skpl-CDC53-F-box(SCF)复合物的多亚基RING E3酶在这个过程中发挥重要作用。在细胞外信号的刺激下，可诱导的磷酸化使得泛素化机器能够识别磷酸化底物并对底物进行泛素化标记，从而启动蛋白质降解。

1.1 SCF E3连接酶在细胞周期中的作用

真核生物的细胞周期是高度有序的调控过程，参与细胞周期调控的的主要调节因子包括：① 细胞周期蛋白，因其含量在细胞周期中呈周期性变化而被发现并得名；② 细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase，CDK)，与细胞周期蛋白结合才具有激酶活性；CDK的激酶活性被顺序激活，从而驱动细胞周期周而复始地转动，细胞不断增殖；③细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDK inhibitor，CKI)，与CDK结合并抑制其活性。

SCF E3连接酶由Skpl、CDC53和F-box蛋白组成，以CDC34作为E2。其中F-box蛋白是最具变化性的组分，它的显著特点是具有一个保守的疏水的约40个氨基酸残基的F盒子，能够特异地识别底物上磷酸化的氨基酸结构。哺乳动物中的F-box蛋白至少有几百种，种类众多的F-box蛋白成为泛素化降解途径底物特异性的基础。SCF E3连接酶主要参与G1-S过渡期调节因子的泛素化降解。

细胞周期蛋白E在细胞中的表达是周期性的，在G1-S过渡期达到最高，在进入S期后下调，是控制细胞进入S期和中心体复制的限速因子。在没有有丝分裂信号时，过高浓度的细胞周期蛋白E-CDK2能加速细胞从C1期进入S期并启动DNA的复制，而且细胞周期蛋白E表达时间过长会导致染色体不稳定，因此在C1期维持一定浓度的细胞周期蛋白E对细胞周期的正常进行非常重要。研究表明，细胞周期蛋白E的降解是依赖于泛素化的。在C1末期，当细胞中的P27(Kip1)浓度降至最低时，细胞周期蛋白E的活性继续增加，细胞周期蛋白E在Thr380发生自身磷酸化，被SCF E3连接酶识别，启动泛素依赖的蛋白质降解。

P27 (Kip1)是哺乳动物细胞CIP/KIP CKI家族的成员，与C1期特异的细胞周期蛋白D-CDK复合物结合后抑制其活性，其浓度在静息期细胞中很高，当细胞从C1期向S期过渡时需要P27(Kip1)的降解。当细胞受到生长因子刺激时，一些与G1-S过渡期有关的基因开始表达，包括细胞周期蛋白E、CDC6基因等。细胞周期蛋白E与CDK2结合形成具有激酶活性的细胞周期蛋白E-CDK2复合物。开始时P27 (Kip1)作为细胞周期蛋白E-CDK2复合物的抑制物存在；当细胞周期蛋白E在数量上超过P27(Kip1)时，后者就作为细胞周期蛋白E-CDK2复合物的底物存在，细胞周期蛋白E-CDK2使P27(Kip1)的Thr187磷酸化，F-box蛋白p45能够识别磷酸化的P27(Kip1)，并介导P27(Kip1)经SCF E3连接酶泛素化降解，细胞从C1期过渡到S期。

1.2NF-κB抑制蛋白的降解

NF-κB是广泛存在于各种类型细胞中的一个转录因子家族。它调节大量与细胞应激反应，如免疫应答、炎症反应和细胞抗凋亡作用相关的基因的转录。NF-κB能够被多种刺激因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-1(IL-1)、细菌脂多糖(LPS)等激活。细胞在静息状态下，NF-κB二聚体与其抑制蛋白IκB结合成三聚体而定位于细胞质中，因为抑制蛋白IκB的2个锚蛋白重复序列封闭了NF-κB分子C端Rel同源结构域的核定位序列。细胞外刺激可以激活蛋白激酶复合物IKK(IκB kinase，由IKKα酶、IKKβ酶和IKKγ/NEMO调节亚基组成)。活化的IKKβ使IκB调节结构域上的2个丝氨酸磷酸化，介导IκB依赖泛素的降解途径．于是NF-κB二聚体被解除抑制，在核定位信号的带领下进入细胞核，调节目的基因的转录。这个过程依赖几个关键的调控步骤。首先，由激动剂如TNF、IL-1或LPS激活IKK；第二步，活化的IKKβ使底物IκB特定丝氨酸残基磷酸化，这就生成了一个能被F-box蛋白β-TrCP WD40重复序列结合的位点；第三步，β-TrCP招募SCF泛素连接酶复合物，将泛素分子交联到IκB邻近磷酸化丝氨酸残基的赖氨酸残基上；第四步，泛素化的IκB被26S蛋白酶体降解，NF-κB进入细胞核。

在炎症发生时激活的NF-κB的IKKβ酶磷酸化IKB的同时，IKKα酶也可以使NF-κB亚单位RelA和c-Rel的C端丝氨酸磷酸化，它可以加速细胞核内RelA和c-Rel的降解，使它们从目的基因的启动子上移开，这样就保证了这些基因启动子适当而且瞬时地被激活。由于很多NF-κB的目的基因编码具有细胞毒性的分子，所以这些基因在正常情况下只能被短暂激活，这在先天性免疫或炎症反应的早期是非常重要的。IKK的2个催化亚单位具有相反且又互补的功能，对于免疫和炎症反应的精确调控是很有必要的。

2. 蛋白质磷酸化直接调控各种泛素连接酶的活性

蛋白质磷酸化在调控泛素化机器识别底物的过程中起主导作用，最近的研究还表明蛋白质磷酸化能直接调控各种泛素连接酶的活性。这种调控模式有很多例子来自细胞周期领域，例如APC复合物(anaphase-promoting complex，促后期复合物)就是一个多亚基E3酶，它能被CDC2介导的磷酸化所激活。相反，BRCA1-BRAD1复合物的E3连接酶活性能被CDK2介导的磷酸化所负调控。除了能调控E3的活性，E1和E2也能被蛋白激酶磷酸化，从而影响它们的催化活性，进而调控蛋白质的降解。

2.1 Mdm2的调控

抑癌基因p53编码的P53蛋白具有转录因子活性，半衰期很短，它的稳定性由泛素依赖的蛋白酶体降解所调控。Mdm2是一种RING锌指E3连接酶，可以促进P53经泛素化降解，在调节P53的活性和稳定性中发挥重要的作用。它同时也是P53转录调控的靶基因，因此Mdm2可以以负反馈的方式抑制P53的活性并加速其降解。

研究表明，Mdm2对P53稳定性的调节依赖于Akt对Mdm2的磷酸化。PI3K/Akt信号通路在细胞增殖、细胞周期及生存中起重要作用，在生长因子刺激下，Akt可以使Mdm2的Ser186 磷酸化，增强Mdm2的活性，促进P53泛素化降解。Akt介导的Mdm2的磷酸化也能调节Mdm2自身的稳定性，可以通过抑制自身的泛素化而减少经泛素蛋白酶体降解。用类胰岛素生长因子刺激细胞，可以增加Akt介导的Mdm2上Ser166和Ser168的磷酸化，从而抑制Mdm2的自身泛素化。Akt介导的Mdm2磷酸化对P53和Mdm2自身的稳定性影响截然相反，可能是在这2个过程中Mdm2结合了不同的E2泛素交联酶所致。

2.2 NEDD4的调控

NEDD4 (neuronprecursor cell-expressed developmentally down-regulated4，神经前体细胞表达的发育负调节蛋白4)属于HECT家族的E3泛素连接酶，它含有HECT催化结构域、C2结构域和WW基序，WW基序负责细胞定位和底物识别。上皮Na+通道(ENaC)是NEDD4的一个底物，能介导Na+进入细胞，由3个同源亚基(α、β和γ )组成，每个亚基都含有PPxY基序，可以与NEDD4的WW基序结合。NEDD4可以通过催化ENaC的泛素化及降解来减少ENaC在细胞表面的表达。血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(SGK)是一种PKB/Akt家族的Ser/Thr蛋白激酶，皮质醛酮可以诱导SGK与NEDD4-2的WW基序结合并使NEDD4-2磷酸化，而磷酸化位点邻近WW基序，减弱了NEDD4与ENaC之间的相互作用，ENaC在细胞表面的表达的增加，导致Na+运输的增加。因此，为了维持Na+的稳态，必须严格调控SGK的表达。很多细胞外信号，包括类固醇激素如皮质醛酮和糖皮质激素，都能在转录水平上增加SGK的水平，但SGK的半衰期很短，提示SGK的水平可能在降解水平上调控。有趣的是，作为SGK底物的NEDD4-2，也可以作为E3泛素连接酶促使SGK经蛋白酶体途径降解。NEDD4-2的磷酸化在SGK降解中非常重要，破坏NEDD4-2磷酸化的突变或抑制SGK的激酶活性都可以减少SGK的降解。这种反馈抑制有可能对上皮细胞Na+的吸收进行精确调控。

3. 小结

在真核细胞中，蛋白质的泛素化和磷酸化是最常见的翻译后修饰。细胞外信号严格调控着目的蛋白的泛素化，在很多情况下，这种调控依赖于蛋白质的磷酸化。磷酸化修饰影响泛素化主要有2种方式，或者通过修饰泛素化的底物，或者通过修饰泛素化机器的某个组分。前者可以影响泛素化机器对其磷酸化底物的识别；后者则可以影响酶与底物的结合能力，或改变酶的催化能力。虽然我们对底物磷酸化影响泛素化机器对其的识别机制的认识已经有所发展，但对泛素化机器自身的调节还有待进一步了解。例如Itch，虽然我们已经知道Itch能被其磷酸化所激活，但我们仍不知道磷酸化是怎样激活泛素连接酶的。因此，这些领域仍是今后几年的研究热点。

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