2018-11-07 18:34:50, 景杰生物 杭州景杰生物科技股份有限公司
景杰编者按:细胞的正常生理活动离不开蛋白质网络的高效、精确的时空调控,因此研究蛋白质互作网络的动态变化需要从以下三个方面来研究:蛋白质互作网络的成员鉴定、其在时间、空间上的变化。质谱结合亲和纯化(AP-MS)可以在时间维度上研究蛋白质相互作用, 也能结合亚细胞分级获得蛋白质网络在空间上分布的信息,但是该方法难以研究蛋白质组瞬时互作的变化。因此如何更加精确地研究蛋白质互作网络是一个亟待解决的问题。美国加利福尼亚大学的研究人员以工程抗坏血酸过氧化物酶(APEX)介导的瞬时标记方法为基础,结合定量蛋白质组学技术,有效地解决了同时捕捉蛋白质互作网络中时空两个维度信息的问题。研究人员通过研究G蛋白偶联受体(GPCRs)介导的蛋白质互作网络证明,该方法能够确定目标蛋白互作网络组成,进行亚细胞定位,捕捉与目标蛋白瞬时结合以及低亲和力partners的信息,成功鉴定了蛋白质互作网络中未能发现的players。上述成果发表在著名期刊Cell上。景杰生物作为全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者,可以为您提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案,同时还能为您提供高灵敏度的修饰类泛抗体,助力您的研究工作。
关键词:APEX Proximity Labeling, Quantitative Proteomics, AP-MS, Protein Interaction Networks
研究思路和成果:
图 1 APEX捕捉蛋白的互作网络
首先研究人员将APEX2与B2AR和DOR受体融合,在HEK293细胞中稳定表达了B2AR-APEX2 和DOR-APEX2片段。激动剂刺激受体活化之后,β-视紫红质抑制蛋白(arrestin3)与受体短暂结合,定量蛋白质组学检测到arrestin3的丰度上升了6倍,证明APEX能够捕捉arrestin3和GPCRs在激动剂刺激下的短暂的互作信息。激动剂刺激之后,不同时间段检测B2AR-APEX标记水平,可以显示出不同时间段与受体结合的蛋白种类,该结果与western blot和SRM方法所验证的结果一致。APEX标记被证实能够捕捉亚基解离的信息,用于不同亚基的解离动力学研究。证明APEX和MS-based label-free定量技术相结合可以捕捉与GPCRs互作的低亲和性,短暂互作和间接互作的蛋白信息(图2)。
图 2 特定空间参照的选择检测出GPCR互作蛋白与普通区室蛋白的表达差异
受体附近存在一些区室特定的非互作蛋白,存在目的蛋白附近,不与其发生物理作用,也不参与其功能,也就是bystanders。研究发现GPCR-APEX融合策略也能标记bystanders蛋白,并且发现这些蛋白并不是没有意义的,它们可以提供有用的受体位置信息(图 2 A, B, C)。实验通过选取空间特异性的参照系统RM-APEX2证实B2AR互作网络中,bystanders蛋白OCLN和RDX的丰度并没有差异,但是受体激活之后发现arrestin3和AP2复合物的丰度显著高于参照系统PM-APEX2。这将有助于区分bystanders蛋白与代谢网络组分。(图2 D, E)结果表明特定的空间参照条件结合label-free MS-based的定量,使得APEX临近标记的网络组分和bystanders得以区分。
图 3 时间分辨的临近标记和空间特定的反褶积确定δ阿片受体的互作蛋白
接下来,研究人员利用选取空间参照的方法研究了未知的互作网络--- DOR互作蛋白网络,来探索该受体下调的分子和细胞基础。受体被激动剂激活之后,在不用时间段比较DOR-APEX标记与相对应参照强度的差异,鉴定出DOR-APEX标记信号比参照更强的蛋白。FDR为0.05,利用SAINT的方法,首次获得了48个特异性蛋白,为了更灵敏更准确地定量,利用定量蛋白质组学的方法重新评估,最后蛋白质组学分析确定了29个与受体和参照的丰度有显著的差异性(p<0.05)的蛋白,这些蛋白的分级聚类和定量结果发现受体被激活之后1-3 min,ARRB2和与网格蛋白介导的内吞功能相关的蛋白AGFG1, ITSN2, EPN2和PICALM丰富最大,中期和后期发现与受体的胞内分选相关的蛋白如中期的ZFYVE20, TGFBRAP1, SCAMP3 和后期的MYOF, WWP2(图 4)。
图 4 WWR2和TOM1是泛素网络的组分并且与DOR向溶酶体运输相关的鉴定
WWP2和TOM1的功能与泛素相关,为了验证其功能利用siRNAs的方法将其敲除,发现WWP2和TOM1的敲除都会抑制受体DOR的降解速率。同时验证了两个蛋白的敲除都不会引起DOR内化的变化,由此确定了两个与受体降解相关的蛋白组分WWP2和TOM1。
总结:本文通过APEX临近标记和定量蛋白质组学结合特定空间参照的方法,使得在时空两个维度上研究蛋白质网络中的“what”,“where”和“when”成为可能,为生物学在分子水平上的研究提供了基础。
参考文献:
Braden T. Lobingier, et al. (2017). An Approach to Spatiotemporally Resolve Protein Interaction Networks in Living Cells. Cell 169, 350-360.
景杰生物通过整合以组学为导向(包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学)的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节,逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条,从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。
06-18 TESCAN中国
解决临床创新“卡脖子”难题,丹纳赫重磅推出医院创新转化解决方案!06-18
徕卡精准空间生物学解决方案 第三弹06-18 郑晓业、童昕
618 嗨购一起“徕” | 网上商城活动来袭!06-18 徕卡显微系统
【培训活动】显微镜成像高阶培训系列(一) 共聚焦多维度成像技术解决方案06-18 徕卡显微系统
【展会】第十五届中国医师协会骨科医师年会06-18 徕卡显微系统
【直播预告】第十届电子显微学网络会议06-18 徕卡显微系统
【案例研究】双视野光片显微镜,适用于类器官及胚胎06-18 徕卡显微系统
议程确定|第四届锂离子电池热测试主题研讨会06-18
文献解读|安徽理工大学马衍坤教授团队《煤炭学报》:震动载荷多次作用下烟煤孔裂隙结构演化特征试验研究06-18 纽迈分析
中国的新质生产力正在服务全球市场!GE医疗北京基地CT交付量达3.5万台/套06-17
兰格ACHEMA 2024展会回顾:探寻精密流体传输市场新机遇06-17
宝英科技推出VOCs治理设施精细化管理实施方案,助力重点行业企业绿色升级06-17 宝英科技
赛默飞X先锋“肽”势:多肽药物研发与创新研讨会06-17
一省检验检测行业营收突破160亿元!06-17
仪器租赁 | 沃特世 液质联用,月租金52000元起06-17
不同行业实验室“以旧换新”,涉及哪些仪器设备?06-17
目标!检验机构总营收超100亿!06-16
一张“A4纸”售价高达万元,这家第三方检测公司是怎么做到的?06-15
GLMY创想仪器丨参加东北地区铸造年会06-15 国产精密仪器厂家