蛋白质组学鉴定拟南芥去乙酰化酶及其底物

景杰编者按：

蛋白质赖氨酸的乙酰化修饰早在1968年就在组蛋白中被报道，但是非组蛋白赖氨酸的乙酰化修饰的发现要等到近30年后，由洛克菲勒大学Robert Roeder实验室证实，p53发生乙酰化修饰，最终对其活性进行调控【1】。

自此以后，非组蛋白的乙酰化修饰就开始吸引研究人员的注意，而如何去寻找发生乙酰化修饰的蛋白成为研究人员亟待解决的问题。直到2006年，时任美国西南医学中心中心的赵英明教授（现为芝加哥大学教授），将抗体亲合层析和蛋白质质谱结合，利用高通量蛋白质组学，在人类HeLa细胞和小鼠肝脏线粒体中鉴定了近200个发生乙酰化修饰的蛋白【2】。参与该研究的还有加拿大Mcgill大学的Xiang-Jiao Yang教授。该研究极大地促进我们对蛋白质乙酰化修饰的了解，更重要的是在方法学证实，利用蛋白质组学研究蛋白质修饰的可行性。

随后2009年，蛋白质组学领域的著名专家，Matthias Mann教授利用亲和层析和质谱结合的技术，获得1750个蛋白上超过3600个乙酰化修饰位点的信息。再次验证了利用组学方法研究蛋白质翻译后修饰策略的可行性【3】。这篇发表在Science上的研究表明，乙酰化的蛋白很多属于蛋白复合体，暗示其参与众多生物学过程。

2010年，来自中国的两个研究组在Science上揭示了蛋白质乙酰化修饰在中心代谢调控中的重要作用。一篇是来自复旦大学赵世民、熊跃和管坤良教授的合作成果：他们发现人的肝脏细胞中，参与中心代谢的酶很多收到乙酰化修饰，该修饰或影响酶的活性，或影响其稳定性，参与细胞对能量响应的调控【4】。参与本研究的还有贺福初院士、复旦大学杨芃原教授、雷群英教授、钦伦秀教授、上海生科院李亦学研究员和美国北卡大学教堂山分校的陈先教授。

在另一篇研究中，复旦大学的赵世民教授和中科院上海植生所的赵国屏院士发现，在原核细胞如沙门氏菌中，中心代谢的众多酶也受到乙酰化调控，从而应对环境中碳源的变化【5】。参与该研究的还有复旦大学管坤良、熊跃教授、上海生化所曾嵘研究员、上海交大姚玉峰教授等人。

前不久，南京农业大学谢彦杰教授、英国利兹大学Christine Foyer教授和景杰生物合作，在水稻叶片中鉴定到多达1024个乙酰化修饰蛋白。表明蛋白质乙酰化修饰从原核生物、植物和动物中高度保守，同时还发现乙酰化修饰和琥珀酰化修饰直接的互作，参与对氧化胁迫的响应【6】。

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）在调控植物生长发育与环境胁迫响应中发挥着重要作用，然而其去乙酰化功能目前也大量局限于组蛋白。研究表明，在拟南芥中存在RPD3/HDA1-like家族、HDT家族、Sir2家族三类共18种HDACs，这些HDACs除了定位在细胞核以外，也在其他亚细胞结构中存在，那么对于非组蛋白的乙酰化与去乙酰化研究，有助于从整体上理解植物乙酰化水平对多种生理生化过程以及环境响应过程的调控与影响。日前，来自欧洲的研究者报道了应用蛋白质组学手段研究并寻找HDACs非组蛋白去乙酰化修饰底物的工作，并首次报道去乙酰化酶HDA14对叶绿体中光合作用中关键酶类的乙酰化水平调控作用。上述研究发表在著名的学术期刊Molecular Systems Biology【7】。景杰生物作为全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者，可以为您提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案，同时还能为您提供高灵敏度的修饰类泛抗体，助力您的研究工作。

关键词：

拟南芥，去乙酰化酶，乙酰化，光合作用

研究思路和成果：

为了研究去乙酰化酶的功能，研究者应用去乙酰化酶抑制剂apicidin与trichostatin A分别处理叶片，随后提取叶片蛋白质进行蛋白质组学与乙酰化修饰组学分析，分析拟南芥叶片整体蛋白质赖氨酸乙酰化修饰图谱（图1）。

图1. 拟南芥乙酰化修饰蛋白的鉴定与注释分析

在该项研究中，作者总共鉴定到6672个蛋白，其中1022个蛋白上一共2152个赖氨酸位点鉴定到乙酰化修饰。与前期的研究比较，一共有959个乙酰化修饰蛋白首次被发现，生物信息学分析表明，亚细胞定位中，叶绿体与细胞核中乙酰化修饰蛋白都存在着高度富集。并且在叶绿体中发现超过29个赖氨酸乙酰化位点在去乙酰化酶抑制剂处理后上调（图2），说明拟南芥中这些去乙酰化酶除了在细胞核中催化组蛋白去乙酰化以外，也可能在叶绿体中发挥功能。

图2. 该研究中鉴定到的叶绿体蛋白赖氨酸乙酰化修饰

接下来，作者通过分离叶绿体并进行Pull-down以及荧光融合GFP蛋白原位表达实验证明了RPD3/HDA1家族成员HDA14在叶绿体与线粒体中存在。且HDA14去乙酰化酶活性在体外受到TSA与apicilin不同程度的抑制（图3）。

图3. HDA14亚细胞定位与体外活性实验

随后，研究者构建了hda14突变体，并通过蛋白质组学手段比较hda14与野生型WT叶片在正常光照与弱光情况下乙酰化修饰水平的变化情况，发现在弱光情况下，叶片中有32个蛋白乙酰化修饰水平显著提高，并且有26个蛋白定位于叶绿体中，其中包括光合作用中非常关键的调控卡尔文循环活性的RCA蛋白K368、K438位点以及RuBisCO大亚基K474位点（图4）。

图4. 野生型与hda14突变体叶片在不同光照下以及类囊体乙酰化修饰水平差异变化

最后作者通过实验证明了hda14突变体中RuBisCO的活性以及期激活状态相较于野生型在弱光条件下有显著提高，说明HDA14可能通过调控RCA K438位乙酰化修饰拮抗弱光条件下叶绿体中升高的ADP浓度对RCA活性的抑制，进而调控弱光下RuBisCO活性（图5）。

图5. RuBisCO活性以及RCA ATPase活性检测

总结：

这项研究应用蛋白质组学手段发现了目前较为全面的拟南芥叶片乙酰化修饰图谱，并且首次报道了作用于叶绿体中的去乙酰化酶HDA14以及其作用底物，揭示了蛋白质乙酰化修饰对植物光合作用调控的重要机制；该项研究也说明，在植物蛋白质翻译后修饰领域，非组蛋白修饰的功能我们可能只看到冰山一角，更多的蛋白翻译后调控机制，有待于更加深入与全面的PTM组学研究。

参考文献

1. Wei Gu and Robert Roeder. (1997). Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain. Cell 90, 595–606. 

2，Sung Chan Kim, et al. (2006). Substrate and functional diversity resource of lysine acetylation revealedby a proteomics survey. Molecular Cell 23, 607–618.  

3, Chunaram Choudhary, et al. (2009). Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science 325,834-840.

4, Shimin Zhao, et al. (2010). Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation. Science 327,1000-1004.

5, Qijun Wang, et al. (2010). Acetylation of metabolic enzymes coordinates carbon source utilization and metabolic flux.Science 327,1004-1007.

6, Heng Zhou, et al. (2017). Oxidative stress-triggered interactions between the succinyl- and acetyl-proteomes of rice leaves. Plant Cell Environ.

7, Markus Hartl, et al. (2017). Lysine acetylome profiling uncovers novel histone deacetylase substrate proteins in Arabidopsis. Molecular Systems Biology.

景杰生物通过整合以组学为导向（包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学）的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节，逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条，从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。