【徕卡学院】电镜样品制备之图像衬度增强技术介绍

根据上述介绍，利用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对网格上的超薄切片进行双染色，这一方法是电子显微镜技术领域的标准常规染色技术。尽管这项技术众所周知，但染色依然是电镜制样最重要的环节之一。除手工操作外，因所使用化学物质的性质而产生的沉淀效应，都属于误差因素。

醋酸双氧铀 (UA) 通过与油脂和蛋白质相互作用能够增强衬度，但若浓度不适且没有将切片上多余的醋酸双氧铀清除，就会生成黄色、针状沉淀结晶。柠檬酸铅通过与蛋白质和糖原互相作用能够增强衬度，如果无法达到完全无二氧化碳的操作条件，就会形成不溶于水的有毒白色沉淀物（碳酸铅）。要避免手工操作过程中产生二氧化碳非常困难，因此，必须借助特殊手段。

采取标准化、封闭式、自动化程序，一方面能够实现可再现性、高样品质量、低试剂消耗等科学需求，另一面，还能满足安全操作条件的需求，避免与危险试剂接触。

针对上述需求，徕卡显微系统开发了一款全自动 Leica EMAC20超薄切片染色机。利用现成的、预先包装好的醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色剂进行自动染色，确保用户最大程度减少与试剂接触的几率，消除以往手工染色过程中存在的所有问题，例如，产生铀酰或铅沉淀物，引起健康风险以及高试剂消耗量等。

在电子显微镜技术领域，最常用的染色剂就是重金属 — 铀和铅。利用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对超薄切片进行双染色，这一手段是电子显微镜技术领域的标准染色技术（图1 和图 2）。

本章节将探讨醋酸双氧铀和柠檬酸铅的化学特性，以及染色过程这两种染色剂所呈现的优、缺点。

图 1：水丝蚓生殖带中的腺细胞颗粒 

图 2：水丝蚓的纵肌

图3：市售的黄色-醋酸双氧铀粉末

由于铀的原子量为 238，构成了醋酸双氧铀（图 3）的下述优势：它能够实现最高的电子密度和图像衬度，并且图像会清晰呈现样品所含的微小颗粒。通过糖蛋白、神经节苷脂等涎酸羧基，将铀酰离子与蛋白质和油脂，以及核酸磷酸基团DNA 和 RNA 相结合。

神经节苷脂属于醣脂类，会在细胞表面聚集。糖蛋白富含所有隔膜，并含有一部分多糖-蛋白质复合物。因此，醋酸双氧铀能够确保隔膜、核酸以及含有核糖体等蛋白质复合体的核酸等达到良好的染色效果。

从左到右依次为：醋酸根离子、铀酰离子、醋酸双氧铀的分子式

醋酸双氧铀溶液

醋酸双氧铀可用作酒精（乙醇和甲醇）或水溶液。上述两种铀酰溶液各有优缺点。

酒精染色剂的优点是，它更容易穿透塑料包埋组织，染色用时短，获得衬度高。

通常将酒精溶液制成 50–70% 乙醇或干甲醇的饱和溶液。

甲醇的溶解度最高。因此，通过饱和的甲醇醋酸双氧铀染色剂，可以获取最高衬度。

酒精，尤其是，甲醇醋酸双氧铀属于化学侵蚀性溶液。所以，使用甲醇醋酸双氧铀时，应考虑采用微孔材料强化萃取技术。酒精醋酸双氧铀会分解colloidin-parlodion 支持膜，如果染色时间延长，它甚至还会溶解 formvar 膜。它还会对很多塑料和橡胶材质产生破坏性影响。

为实现醋酸双氧铀染色剂的特殊效果，应将其作为水溶液使用。

醋酸双氧铀溶解于水时，根据浓度范围 0.5% - 3%，该溶液的pH 值范围为 4.2 至 4.9。在上述 pH 值范围内，带正电荷的铀酰占主导，染色剂溶液能够确保适当的衬度。核酸等负带电分子具有极佳的染色效果。

水染色剂不稳定，且在上述 pH 值范围内，感光性较强。光照和溶液的熟化会导致氢氧化铀和四价氢氧化铀产生沉淀现象。

若存在特定有机离子，例如，包埋介质中的未聚合单体，四价铀也会产生沉淀物，如下所示：

由于染色剂的 pH 值较低，因此，不建议使用在酸性条件下不稳定的试样。另外，当染色剂达到生理pH 值，并存在很多盐分的情况下，会产生沉淀物，此时，需要特别注意。因此，应将过滤后的染色剂存放在暗处，温度要求为 4°C，在这种存储条件下，该染色剂可以保存数月之久。

为避免因存储时间长而产生沉淀现象，必须确保醋酸双氧铀的稳定性。酸化作用能够维持醋酸双氧铀的稳定性，完全避免出现沉淀。但是，酸化作用会极大降低染色效果。当pH 值为 3.5 时，铀酰离子能够强力附着在 DNA 上，当 pH 值为 4.0 时，仅 DNA 带有负荷电，导致这种附着力更强。当 pH 值在 3.5 以下时，铀酰染色剂与组织成分的相互作用极其微弱：因为当pH 值较低时，大多数蛋白，甚至核酸，均不再带有负荷电。

Leica Ultrostain I（醋酸双氧铀溶液）

Leica Ultrostain I 相当于 0.5% 稳定的醋酸双氧铀溶液（pH值为 4.4）。用预制好的 200ml 容量的棕色瓶予以盛装，以避免光照。上述作业需在化工生产厂的特殊风险实验室内完成，它所要求的作业条件是电子显微镜实验室所无法达到的。

在常规染色过程中，通过反复更新染色剂，以及日常过滤和离心分离的方式，很容易解决醋酸双氧铀的问题。醋酸双氧铀呈大片针状结晶或菱形晶体（或粒状团聚体，图4）。

图 4：醋酸双氧铀沉淀物

注意：醋酸双氧铀有剧毒，这种毒性是化学毒性和轻微放射性叠加产生的组合效应，如果长期暴露在这种毒性环境下，会因累积效应而造成伤害。称取粉末时，应小心、谨慎，务必穿实验服，佩戴乳胶手套、防护面罩，以及其他适当的防护设备（请联系实验室安全员！）

• 乳胶手套、实验服、防护面罩
  

• 200 ml 棕色贮存瓶（必须极其干净！）

• 100 ml 量瓶（必须极其干净！）

• 50 ml 移液枪（必须极其干净！）

• 天平（置于通风柜下）

• 称皿

• 加热板

• 磁搅拌器和搅拌杆

• Whatman #1 滤纸

• 玻璃漏斗

• 醋酸双氧铀二水合物粉末（殆尽贫化）[U(C2H3O3)2 ×2H2O]，4 g

• 无二氧化碳双蒸水，125 ml

注意：一旦玻璃器皿被重金属染色剂污染，禁止再用该器皿制备其他化学溶液。

1. 在通风柜下（佩戴防护装备！），称取 4g 醋酸双氧铀，加入 100ml 量瓶中。用移液枪抽取 96 ml 近沸的、无二氧化碳双蒸水，滴入装有醋酸双氧铀的量瓶中。
   

2. 用搅拌子搅拌，直至醋酸双氧铀二水化合物晶体溶解。这可能需要一点时间。溶解后，静置溶液，冷却至室温。

3. 用 Whatman #1 滤纸将醋酸双氧铀过滤到 200 ml 棕色瓶中（避免光照），盖紧瓶盖，贴上标签。上述原液可在4°C 贮存条件下存放数月。

4. 将被污染的玻璃器皿放在原本盛装醋酸双氧铀溶液的废瓶中进行冲洗，并将该器皿与实验室玻璃器皿分开存放。被醋酸双氧铀污染的固体废物必须放在专门用于放射性废弃物处置的固体废物箱中进行处置（请联系实验室安全员！）

柠檬酸铅能够增强各类多孔结构物质的染色效应，例如，核糖体、脂质膜、细胞骨架以及细胞质的其他隔室等。染色效应取决于减少锇之间的相互作用，因为它能够令铅离子附着在分子的极性基团上。常规情况下，锇可用作固定剂。柠檬酸铅还与醋酸双氧铀发生较弱的相互作用，因此，醋酸双氧铀染色后，可以进行柠檬酸铅染色。

柠檬酸铅的缺点是在实验室条件下存在不可预测性，耗费时间，且需要精心制备（参见图7）。当用于制备染色或用于冲洗的空气或水中有二氧化碳时，柠檬酸铅很容易产生沉淀物。碳酸铅 (PbCO3) 是一种不溶于水的白色有毒沉淀物，因此，无法溶于冲洗水。通常情况下，所有柠檬酸铅等铅盐都有剧毒。

柠檬酸铅分子式 

与铀酰溶液一样，铅水溶液的染色效果关键取决于溶液的 pH 值。但与铀酰不同的是，即使在pH 值很高 (>12 pH) 的情况下，也可以使用铅基染色溶液。

碱性 Wenable & Goggeshalls 和Reynold 的铅水溶液最为常用。由于柠檬酸铅的商业品质常常达不到染色的质量要求，因此，相对来说，在上述方法中，Reynolds (1963) 在常规程序中更为可靠。在Reynolds 方法中，柠檬酸铅是柠檬酸钠和硝酸铅之间发生反应的产物。

所有碱性铅染色剂都可以用作稳定剂。因此，如果上述溶液的制备环境能够避免形成碳酸铅，则上述溶液适用于商品化处理。

Leica Ultrostain II

Leica Ultrostain II (柠檬酸铅溶液）

Leica Ultrostain II 相当于 Reynolds 柠檬酸铅。在氦气气氛下，将3% 柠檬酸铅溶液预先包装在真空密封袋中。上述作业将在化工生产厂的特殊风险实验室内完成，作业时，必须极端小心谨慎。它所要求的作业条件是标准的电子显微镜实验室内无法达到，作业时，必须小心、谨慎。

碳酸铅 (PbCO3) 是一种不溶于水的白色有毒沉淀物。

在电子显微镜下，该物质呈黑色粒状。这些沉淀物可能颗粒体积较大（图7a），但数量较少，也可能是细颗粒沉淀物将切片广泛覆盖（图 7b）。

图 7a：

图 7b：

 注意：铅盐是剧毒物质。称取粉末时，应小心、谨慎。佩戴适当的防护装备。

• 50 ml 量瓶，带塑料或玻璃塞（必须极其干净！）
  

• 25 ml 移液枪（必须极其干净！）

• pH 计（必须极其干净！）

• 磁搅拌器和搅拌子

• 硝酸铅 [Pb(NO3)2]，1.33 g

• 柠檬酸钠 [Na3(C6H5O7) × 2H2O]，1.76 g

• 无二氧化碳双蒸水，100 ml（新鲜制备，且至少冷却至 25°C）

• 1 N NaOH，10 ml（在无二氧化碳双蒸水中新鲜制备）

1. 称取 1.33 g 硝酸铅、1.76 g 柠檬酸钠，依次放入 50ml 量瓶中，加入 30 ml 无二氧化碳双蒸水。震摇溶液，每次震摇几分钟时间，分别振荡 5 - 6 次，共计振荡约 30 分钟，使之形成不含大颗粒的乳白色铅染色剂悬浮液。如果溶液有块状，继续振荡摇匀，直至颗粒分离，或再重新振荡一遍。在搅拌盘上搅拌，直至醋酸双氧铀二水合物晶体（图3）溶解。这项操作可能需要一点时间。溶解后，静置溶液，冷却至室温。
   

2. 搅拌时，向悬浮液中加入 5 至 7 ml 1 N NaOH，使乳白色溶液变透明。如果没有变透明，再加几滴NaOH 至 8 ml。如果溶液仍未变透明，那么，肯定是出现了问题，应将染色剂弃置！将被污染的玻璃器皿放在原本装醋酸双氧铀溶液的废瓶中冲洗，并将其与实验室玻璃器皿分开存放。被醋酸双氧铀污染的固体废物必须放在专门用于放射性废弃物处置的固体废物箱中进行处置（请联系实验室安全员！）

3. 将少量干净的染色剂取回，用 pH 计测定 pH 值。pH 值应为12.0 +/- 0.1。如果 pH 值过低，则向第 2 步量瓶干净溶液中加入更多 NaOH。如果 pH 值超过 12.1，则重新开始上述步骤。

4. pH 值检测后，向量瓶中加入无二氧化碳水，直至溶液的最终容量达到50 ml。用塞子将量瓶紧密塞住。

5. 在密封良好的条件下，溶液可存放达 6 个月。使用前，应对溶液进行离心处理（5,000×g/10分钟），或用微孔过滤器对溶液进行过滤。

注意：对于上述染色剂，pH 值的精确测定极为重要。如果从 pH12.0 开始，pH 值的变化超过 0.1 个单位，则表明染色较差或发生沉淀现象。

在电镜制样过程中，切片的手工染色是最容易导致实验失败的。这里采用的方法是，将网格盖在几滴醋酸双氧铀溶液上，保持一定时间后，用镊子将网格取走（图8a 和 8b）。随后，将网格盖在几滴柠檬酸铅溶液上之前，将网格用水冲洗几遍（图 9a 和 9b）。为了防止柠檬酸铅因暴露于二氧化碳环境下而出现沉淀现象，将几片NaOH 粒块放在染色皿上（这里用的是有盖培养皿），以便排除大气二氧化碳。此外，冲洗水不得含有二氧化碳（应采用双蒸水）。染色后，再次以水浴法和水柱将网格冲洗几遍（图9c）。通过毛细作用和干燥处理后，对网格进行化验分析。

手工染色过程的主要问题是，在染色过程中，会形成金属盐沉淀，尤其是铅沉淀现象。使用NaOH 粒块以最大程度地减少沉淀，也是一种常用的技术。但即便采取最严密的预防措施，在染色最关键的半个小时里，沉淀物也可能令数个小时甚至好几天的辛苦努力功亏一篑。

另一个常见问题就是网格的反复使用，很容易导致支持膜，甚至切片损坏。

由于操作过程中涉及好几个手工步骤，因此，在整个染色期间，操作员必须确保在场。此外，当只能同时对少量网格进行染色时，常常需要重复操作。因此，手工染色会导致电镜实验室的工作量剧增。如果需要进行多序列或长连续切片的染色，尤其是如果染色用时较短时，可再现性很难保持一致，有时甚至难以实现。

最后，在染色剂制备期间，因反复处理危险化学品会导致健康危害增加，这是手工染色的主要缺点。

图 8a： 

图 8b： 

图 9a： 

图 9b： 

图 9c： 

基于对固定在网格上的超薄切片进行双染色的传统手工方法，Leica EM AC20 实现了这一手工方法的自动化。这款仪器的技术设计解决了手工染色存在的大部分传统问题，例如，沉淀、染色不均等问题。另外，它能够同时对 20 个网格进行染色，这项自动化技术提升了实验室工作的效率，并实现了染色效果的标准化。因此，利用EM AC20 实现全自动染色，能够消除传统的染色问题，减少健康危害，从而使电镜实验室的工作得到了广泛认可的改善，让操作员有更多的时间投身于更有价值的工作上。

该仪器使用预先包装的醋酸双氧铀和柠檬酸标准溶液，最大程度地减少用户接触危险化学品的时间，消除因受控、标准化染色剂制备和装瓶而造成的沉淀和污染现象（参见第2 章）。Leica EM AC20 关键在于采用蠕动泵和非接触式阀门设计，试剂直接进入气密封的样品室管道。这种泵-阀-管道系统包含两个互相独立的管道装置：一个管道装置能够确保试剂和冲洗水以受控的方式流至网格室（图9b）；另一个管道装置则可将废液从样品室导流入专门的废液瓶中。（备注：欧盟禁止出口醋酸双氧铀溶液）

在染色技术中，对衬度质量影响最大的因素是染色液的品质和浓度。除了染色剂外，固定剂、缓冲液、冲洗水、脱水作用、冲洗时间、包埋介质的种类以及聚合作用等级和切片厚度等，这些因素也会影响图像衬度。

常规因素

固定剂

四氧化锇固定剂能够增强衬度。在与醋酸双氧铀和柠檬酸铅相互作用的后染色期间，它可以用作固定剂和强化剂。研究表明，固定时间会影响醋酸双氧铀染色所获取的衬度。通过四氧化锇的长时间固定作用会降低核染色质等的衬度。

缓冲液

铀酰会与卡可基酸盐和磷酸盐离子发生强化学反应，产生铀酰盐沉淀现象。因此，充分固定后，冲洗样品时，能够确保较高的衬度，亦不会产生沉淀。

即使脱水和包埋后，磷酸盐缓冲剂仍会保留在组织中，这种现象通常会导致肌肉和神经组织产生较小的局部致密沉积物。

冲洗水

冲洗水中的二氧化碳成分会导致碳酸铅沉淀，从而影响图像衬度。新鲜蒸馏水的pH 值接近中性。将蒸馏水静置较长时间后，水中的二氧化碳会溶解。 此外，冲洗水 pH <6.0，降低了醋酸双氧铀形成的衬度，从而影响整体衬度。如果水的pH 值低于 6.0，则应加入 KOH 予以中和。冲洗水还应进行脱气或煮沸，以防水中产生气泡，如果水中有气泡，应紧密贴合染色舱室中的网格，并抑制染色。

包埋介质

研究发现，Epon 以及 Epon 替代品能够以相似的方式实现染色，因此，无需特别处理。众所周知，环氧树脂是一种能够提供固有背景的染色剂。因此，建议在较低温度条件下，缩短染色时间。通常，Spurr包埋树脂染色所需的时间更长。对 Spurr 染色时，不建议升高温度，因为与环氧树脂一样，包埋树脂自身的背景亦倾向于占据染色剂。经过包埋的试样所处阶段非常重要，因为包埋材料在存储期间会持续发生聚合作用。旧的试样和切片进行醋酸双氧铀染色的时间更长。

切片厚度

薄切片比厚切片的衬度低，但分辨率更高，因其厚度有限染色剂很难有空隙附着。因此，薄切片比厚切片需要更长的染色时间。

聚合程度

聚合程度较低的包埋介质是质软，难以切割，且被染色剂侵染速度快。因此，建议在较低温条件下，缩短染色时间。

整块染色

近年来，将试样在包埋前进行染色，成为非常普遍的处理方法，这种方法能够增强衬度效果且不会生成沉淀。

但是，在大多数的研究过程中，仅“整块”染色无法充分的增强试样的衬度。而使用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对切片进行后染色的方法更受大部分教科书的推崇。

本文经Leica Microsystems Science Lab许可翻译。若需引用或转载，请联系我们，注明源自徕卡显微系统，并保留徕卡显微系统、Science Lab及原作者相关版权信息。