【徕卡课堂】钙信号哪里跑?钙成像指示剂与显微成像系统帮你找！

钙是机体的组成元素之一。钙离子作为电流载体维持细胞内外的电化学梯度，同时在细胞的生命活动中扮演着重要角色。作为第二信使，钙参与细胞周期、细胞代谢、细胞分化、坏死、凋亡等等许多重要的生理过程。

细胞内的钙离子水平通常很低，一般胞浆中的自由钙约为100nM。胞内的钙可被各种亚细胞器所贮存，据文献报道：其中约50%位于细胞核，30%位于线粒体，14%位于内质网，5%位于胞膜上， 1%位于胞质内，且因为钙离子易与磷酸和碳酸复合物形成不溶物，故游离钙只占0.01%[1]。

细胞可以通过钙内流、内钙释放及膜系统上的降钙蛋白等一整套完整的监控系统来维持细胞内钙的内稳状态。例如与钙内流相关的通道例如电压门控性钙离子通道VDCC、受体激活的通道RACC；与内钙释放相关的受体如内质网上的IP3受体；以及降钙相关的脂膜及线粒体上的主动运输的钙泵系统等等[2]。

近20年来钙的荧光成像及测定技术发展迅速，出现了各种各样的钙荧光指示剂，结合不断发展的显微成像系统，我们可以对活细胞的钙离子进行测定及成像，进一步揭示其生理机制及相关疾病的发病机制。

钙成像的荧光指示剂

钙成像的荧光探针一般均为Ca2+螯合剂EGTA，APTRA，BAPTA的衍生物，它们可以结合钙离子从而显示一个光谱响应，使研究者可以用荧光显微镜来观察细胞内的自由钙的浓度。

目前商品化成熟、应用广泛的常用钙成像荧光指示剂如下表所示：

表格1 常用钙成像荧光指示剂

在选择Ca2+荧光指示剂时，许多因素需要考虑，其中几个重要因素概括如下：

指示剂的形式：指示剂有多种形式，包括盐、酯、葡聚糖偶联物的形式。不同的指示剂需要不同的细胞负载方法，并且影响指示剂在细胞内的分布和保留。盐和葡聚糖形式的指示剂一般通过显微注射、微粒轰击、电穿孔的方法负载，而酯类指示剂，因乙酰甲酯为细胞可渗透，可被动运输进入细胞，随后被细胞内的酯酶分解为细胞不能渗透的形式，从而保留在胞浆内。

测量模式:确定是需要做定量和定性离子浓度的测定。因为离子指示剂通过和离子的结合会发生光谱移位，从而可以用比例法测定钙离子的浓度，而不受约束于染料的不均匀负载、细胞的厚度、光漂白的影响和染料渗漏等因素。激发和发射波长取决于所使用的显微成像设备的配置，包括样品的自发荧光以及实验中存在的其它荧光和光激活探针。

解离常数：必须与要测定的钙离子浓度相匹配。Kd值大，表示染料对钙离子的亲和力低，Kd值越小，则表示染料对钙的亲和力越大。指示剂在接近0.1Kd到10Kd浓度范围内有可探测响应。钙离子指示剂的Kd值依赖于许多影响因素，包括pH，温度，离子强度，粘度等等。并且通常在体测定的Kd值要远高于体外测定值。

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指示剂的负载和校准

负载：指示剂需要定位在需测定离子浓度的细胞的特定区域，通常为胞液中，有时会是在线粒体中。[6]

图1. 钙指示剂（A）生物发光蛋白。结合钙离子的水母发光蛋白导致荧光素辅基被氧化。氧化的荧光素返回基态发出470nm的荧光。（B）化学钙指示剂。Fura-2被紫外光激发（350nm/380nm）并且其发射波谱在505和520nm之间。Fura-2结合钙离子导致发射荧光波谱的改变。（C）基于FRET的基因编码的钙指示剂。两个荧光蛋白ECFP(供体)和Venus(受体)通过结合钙离子，发生荧光能量共振转移，从而480nm的蓝色荧光减弱而同时530nm的荧光强度增强。（D）基因编码的单荧光基团的钙指示剂。在结合钙离子后,GCaMP的分子内构象发生转变导致515nm的发射荧光的增强。

应用于大批细胞的主要负载方法有：酯载法、ATP诱导透化载入、电穿孔、低渗冲击、微粒弹射。

应用于单个细胞的主要负载方法有：显微注射及膜片尖端扩散法。显微注射法可将膜不通透的染料，及蛋白质染料直接注入细胞内，浓度精确，但技术要求高，对细胞损害大；膜片尖端扩散法可将电生理膜片钳和钙离子测定相结合，并且适用于任何染料形式。[6]

图2. 染料的负载方法。（A）单细胞的负载方法：尖锐的电极刺穿（左），整个细胞膜片钳（中），单细胞电穿孔（右）。（B）网络负载 ：许多神经细胞通过酯载法进行染料负载（左），或者通过葡聚糖交联染料负载（中），通过电穿孔方法（右）(C)基因编码表达的钙指示剂：通过病毒转导（左），母体子宫内的电穿孔（中），通过转基因老鼠的繁殖（右）。

虽然钙离子测定操作简单，但仍有许多问题值得注意：

指示剂的区室化:染料因不完全水解造成的被动扩散、细胞器上的阴离子转运通道、细胞器的酯酶活性高等原因而造成染料不均匀分布于胞浆，却被细胞器所捕获。故不能准确的指示胞浆钙信号的变化。

指示剂的渗漏：染料由于质膜上的阴离子转运通道及不完全水解而从胞内渗漏到胞外，从而降低了负载效率。

指示剂的淬灭：随着长时光照而造成的指示剂的淬灭，也会进一步影响信号强度的指示。

自发荧光：细胞内某些成分的自发荧光信号干扰，如NADH（EX340nm，EM440~470nm）和FAD(EX450nm，EM530~550nm)的自发荧光，可通过减去负载前的背景荧光而得以校正，或者使用长波长指示剂来避免。

钙指示剂体外校准通过使用EGTA缓冲液来进行。通过Ca2+-EGTA复合物的已知Kd来计算出Ca2+的浓度，再将此复合物作为测定对象，利用荧光指示剂测定钙，获得F、R、Fmin、Fmax、Rmin、Rmax值，并按照公式回归拟合，得到Kd，用来校正测钙所得F、R值；体内校准胞内的指示剂通常用ionomycin等离子载体让可控的胞外的离子浓度和胞内离子浓度达到平衡，从而进行校准。

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紫外激发的Ca2+荧光指示剂

Fura-2和Indo-1是紫外光激发，比例成像钙离子指示剂。Fura-2在结合钙后，其激发峰从363nm变到335nm，而发射峰(510nm)没有明显变化（如图1所示）；Indo-1则在结合钙后，其激发峰（338nm）无明显变化，发射峰发生一个漂移，从475 nm到401nm；故使用Fura-2和Indo-1做指示剂时，可利用比值法F340/F380或者F405/F480来测定钙[7]。

图3. 在不同的钙浓度下的Fura2的荧光激发波谱，参照Molecular Probe。

Quin-2较Fura-2和Indo-1有较低的量子产率，故所需负载浓度更大。

中等钙亲和的指示剂包括Fura-4F、Fura-6F、Fura-5F适用于测定约1uM的钙离子浓度，Fura-FF是Fura-2的二氟化衍生物，尤其适用于研究胞内钙存储的空间和功能特性并可用以追踪由三磷酸肌醇受体驱动的钙振荡。

低亲和的钙指示剂例如BTC，这种指示剂在结构钙后，激发峰从480nm迁移至400nm，可用于比例成像。

紫外激发的指示剂可以通过紫外光进行激发来指示钙信号，也可以用双光子显微系统的长波长进行激发，可以进一步减轻细胞毒性，所成图像获得更好的空间分辨率。

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可见光激发的Ca2+荧光指示剂

用可见光激发的钙指示剂，包括常用的Fluo-3,Fluo-4,Rhod-2等及相关的衍生物，更便于使用普通的共聚焦系统来进行钙成像。

Fluo-3在结合钙后会有约100倍的荧光信号的增强，故可以测定钙，可用类似FITC的激发条件和发射接收即可进行钙成像。

Fluo-4在结合钙后也会有荧光信号的增强，其激发和发射与Fluo-3相同，用普通共聚焦检测到的荧光信号至少是Fluo-3的两倍。

Rhod-2和X- Rhod-1为长波长的钙指示剂，可以用来测定有很强自发荧光的细胞和组织中的钙，也可以用来测定由光受体及光激活螯合剂产生的钙释放。

可用于指示线粒体钙瞬变的指示剂有Rhod-2，X- Rhod-1，Rhod-FF，X-Rhod-5F。

Calcium green发射峰约在530nm，量子产率为0.75比Fluo-3（0.14）高很多。 

另外这一系列还包括Calcium orange 和Calcium crimson，这两个指示剂的发射峰分别为580nm和620nm。

Fura red可以用双波长激发（420/480），见图4[8]。可与Fluo3 或者Calcium green一起使用，进行双发射波长比值测定。

图4.在低钙（A）和高钙(B)状况下负载Fura red的天鹅属烟草触角神经叶的大约15个细胞簇。（C）用457nm和488nm激发的追加尾色的原始图像：通过4-bromo-A23187及离子霉素通透进行触角神经叶神经细胞的比例荧光的Fura red 的校准。如图所示，结合钙离子后F457nm/F488nm比例荧光强度增加。

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荧光蛋白Ca2+指示剂

Cameleon蛋白复合体，可利用FRET现象间接测钙。Cameleon蛋白复合体包括：钙调蛋白（CaM），是细胞内最为普遍的钙受体，肌球蛋白亲链激酶（M13），荧光供体和受体（CFP/YFP）或者（BFP/GFP）分别与CaM和M13连接。CaM呈哑铃状，一旦与钙结合，构象发生转变，CFP与YFP间距离缩小而发生FRET，当用440nm波长激时CFP 480nm荧光减弱，而YFP530nm荧光增强，可以用FYFP/FCFP间接衡量钙信号。见其中一个应用实例（如图6所示） 

图5. Cameleon基于FRET测定钙原理

图6.用Cameleon蛋白复合体测定HeLa细胞的钙离子成像。A,B显示了在HeLa细胞中YC6.1（左） 和YC2.1（右）的胞质定位（440 ± 10 nm激发，535 ± 12.5 nm发射）的荧光图谱。YC6.1 和YC2.1为不同的Cameleon蛋白复合体。C,D显示了用10 µM组胺刺激，比例荧光（从535 ± 12.5 nm 到480 ± 12.5 nm）及荧光强度（535 ± 12.5 nm 和 480 ± 12.5 nm）变化。细胞每隔5S用成像采集。右边的坐标轴给出Rmin and Rmax值。[9]

钙测定的显微成像系统

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荧光显微镜

可以使用普通的倒置荧光显微镜来进行钙信号的测定和成像 。并可结合电生理设备、活细胞培养装置等，适用于大强度、广范围的钙信号测定。例如徕卡的倒置显微镜系列DMi8，可选配快速外置转轮、高速相机、相应滤片等硬件来实现钙的比例荧光成像（见图7、8、9）。

图7.Leica DMi8 +DFC9000T(sCMOS，50fps成像速度)

图8.快速外置转轮可实现相邻滤片21ms的切换速度

图9.新的高紫外通透物镜非常适合于钙成像的应用

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共聚焦显微系统

共聚焦以激光为光源，且可配备氩离子光源，可以选择可见光激发的钙指示剂，进行层扫，相比普通荧光显微镜有更好的空间分辨率。并且徕卡共聚焦除了配备大视野扫描镜更可配置共振扫描振镜（见图10），以满足更高速成像应用的需求。

图10.徕卡共聚焦可选配的大视野扫描器及高速共振扫描器

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多光子显微系统

使用长波长来激发荧光指示剂，具有较低的细胞毒性，也可适用于紫外激发的钙指示剂，且可获得和单光子共聚焦系统类似的空间分辨率。

小结

综上可见，在研究钙信号时，可结合样品自身特点来选择相应的钙指示剂，并考虑既有的实验设备，来确定具体的实验方案。同时还需进一步摸索实验数据的校正、控制等多种影响因素，最终才可获得可靠的图像及荧光定量数据。

参考文献

[1]史娟，李继硕。细胞内钙成像和钙测定的基本原理及应用。July.2006 22(4) ：455-462c.

[2]Kochegarov AA. Pharmacological modulators of voltage-gate calcium channels and their therapeutical application. Cell Calcium. 2003 Mar; 33(3):145-62.

[3] The Molecular Probes® Handbook. A guide to fluorescent probes and labeling technologies 11th Edition (2010). Chapter 19 Indicators for Ca2+, Mg 2+, Zn 2+ and Other Metal Ions: 833-861.

[4]R. Madelaine Paredes, Julie C. Etzler, Lora Talley Watts, and James D. Lechleiter .Chemical Calcium Indicators. Methods. 2008 November ; 46(3): 143–151.

[5] Martin D. Bootman, Katja Rietdorf, Tony Collins, Simon Walker and Michael Sanderson. Ca2+-Sensitive Fluorescent Dyes and Intracellular Ca2+ Imaging. Cold Spring Harbor Protocol.

[6] Christine Grienberger and Arthur Konnerth. Imaging Calcium in Neurons. March 8, 2012,Neuron 73：862-885.

[7]Widefield Calcium Imaging with Calcium Indicator Fura2.Leica Widefield Application Letter. Resolution Sep.2007 No.01.

[8] Christian Lohr. Monitoring neuronal calcium signalling using a new method for ratiometric confocal calcium imaging. Cell Calcium 34 (2003): 295–303.

[9] Kevin Truong , Asako Sawano, Hideaki Mizuno, Hiroshi Hama, Kit I. Tong , Tapas Kumar Mal , Atsushi Miyawaki and Mitsuhiko Ikura. FRET-based in vivo Ca2+imaging by a new calmodulin-GFP fusion molecule. Nature structural biology .volume 8 number 12 .December 2001.

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