课堂 | STED超高分辨率的火眼金睛之神经细胞研究（一）

了解分子的定位、修饰和分子间的互作等是深入理解细胞功能的先决条件。过去几十年，将感兴趣的蛋白用荧光探针进行标记后在荧光显微镜下观察其分布已经成为非常常规有效的方法。

图1. 悬浮液中的活体T细胞

普通光学显微镜可以看到较厚的组织样品，且允许多个通道同时成像，可以同时检测多个不同的分子。但由于衍射极限的存在，普通光镜分辨率只有200-300nm。而神经生物学中，构成神经回路的重要组分，如突触、树突棘等的大小只有几十纳米，远远小于普通光镜的分辨率。因此利用传统的光学显微镜无法得到这些组分的精细结构，虽然电镜分辨率足够，但却只能观察到固定的样品中非常局限的范围。

超高分辨技术的出现填补了传统光镜和电镜之间的分辨率空白，成为高效方便的观察神经系统精细结构的理想工具。STED（受激发射损耗）是唯一的纯光学超高分辨率显微技术，可产生低于50纳米的结构分辨率而无需进行数据处理，在神经科学领域有其独到的应用。

今天，小编就给大家介绍神经细胞研究大咖的两篇成果，以及他们如何使用Leica SP8 STED发现神经细胞世界的不一样和未知！

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Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus

Nature.  2015 Jul 30;523(7562):592-6. doi: 10.1038/nature

14467. Epub 2015 Jun 22.

作者首先在活体小鼠的CA1海马区使用双光子显微内窥镜，长时间持续监测锥体神经元的基底树突棘和突触后结构的动力学，以表征兴奋性突触连接的变化。数学建模显示，CA1区有一群树突棘的平均寿命大约为1-2周，虽然阻断NMDA受体可以稳定新皮层的树突棘，但是在CA1中，它短暂地增加了树突棘损失的速度并由此降低了树突棘的密度。这些结果显示， CA1的树突棘动力学与之前在新皮层中看到的截然不同。

图2.  锥体神经元树突棘结构的时间变化

使用双光子时，由于海马的树突棘比新皮层更密集，而衍射极限的存在导致双光子显微镜的分辨率不够高，无法区分间隔非常近的两个或两个以上的树突棘。

图3.  双光子图像与STED图像的对比

为了测量相邻树突棘汇合到一起的程度，作者使用Leica SP8 STED显微镜检测了Thy1-GFP小鼠的组织切片。SP8 STED显微镜提供70 nm横向分辨率，比双光子显微内窥镜的图像（分辨率610 nm）精细近9倍，允许测量比较相近的CA1树突棘图像，图3。

图4. 两个棘或三个棘被双光子识别成一个棘的比例

双光子图像中出现的一个树突棘，在STED图像中其实是相邻的两个树突棘融合在一起的。在双光子图像中出现的151个棘突中，23±3.6％实际上是两个棘，6.0±1.6％实际上是三个棘（n = 12个树突），图4。

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Releasing Syntaphilin Removes Stressed Mitochondria from Axons Independent of Mito-phagy under Pathophysiological Conditions 

Neuron. 2017 May 3;94(3):595-610.e6. doi: 10.1016/

j.neuron.2017.04.004.

线粒体为细胞提供能量，维持钙离子的动态平衡，对细胞的生存和功能至关重要。而神经元是一类高度极化的细胞，具有延伸的轴突，线粒体需要经历长距离运输才能到达生长锥和突触末梢以满足高代谢的需求。如果线粒体完整性受损，应激条件会导致线粒体在数周内老化并丧失功能。已有文献表明神经退行性疾病包括AD和ALS中存在慢性线粒体的应激和运输受损。长期应激压力导致受损线粒体在轴突积累，不仅造成产能效率低下，而且还释放有害的活性氧。

所以提前清除轴突的缺陷线粒体是线粒体质控的关键。PINK1 / Parkin通路已被认定为关键的线粒体质控机制。然而，原代神经元经常表现出比Parkin通路激活更早的线粒体自噬，所以可能存在其他的机制。

图5. 分散在细胞内的纳米级SNPH囊泡

作者利用免疫电镜和超高分辨技术研究了野生型神经元的轻度线粒体应激和ALS-和AD-神经元中的慢性病理性应激，证实线粒体运输对保持其完整性至关重要。

早在Parkin介导的线粒体自噬被激活之前，受损的线粒体可以被线粒体锚定蛋白syntaphilin (SNPH)和一类新的货物蛋白清除掉。SNPH的选择性大量释放增强了线粒体的运输，而且在ALS和AD的早期疾病阶段也能观察到SNPH的释放。文章揭示了一种shousun 线粒体清除的新机制。

图6. STED时间序列成像显示SNPH囊泡因受刺激而被大量释放

鉴于SNPH货物囊泡的小尺寸（100 nm 直径），作者使用Leica SP8 STED显微镜进行观察，达到了30-70纳米分辨率，观察到散在的SNPH囊泡（图5）; 使用时间序列STED成像监测GFP-SNPH的动态大量释放，可以清楚区分GFP-SNPH 和线粒体基质的空间定位（DsRed-Mito）（图6）。

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