基因毒性杂质监测中苯磺酸和对甲苯磺酸酯UPLC/UV-MS分析方法

烷基磺酸酯，尤其是甲磺酸酯、苯磺酸酯和对甲苯磺酸酯，在制药行业中常被用作烷基化试剂和催化剂，还常应用于药物化学合成的纯化步骤。合成反应或再结晶步骤中任何残留醇类的存在都可能导致形成磺酸的烷基酯。许多甲磺酸酯、苯磺酸酯或甲苯磺酸酯都已被证明具有基因毒性，而其它此类酯类也可能存在潜在基因毒性，因此必须在药物和药品中对这些物质进行监测。

按照美国FDA指南草案和EMEA指南的要求，必须对药物或药品中任何可能存在、未在早期合成步骤中予以清除的所有基因毒性杂质进行监测，确保其含量低于1.5 µg/天的毒理学关注阈值（TTC）（基于药物化合物的每日最大剂量）。对于不同的活性药物成分(API)，分析方法的灵敏度要求可能极具挑战。

对于每日最大剂量为1000 mg的药品来说，所含有的各种基因毒性杂质的分析结果都必须小于以下TTC水平：

因此，药品或药物中的基因毒性杂质含量必须低于1.5 ppm。监测烷基磺酸酯的一种最常用的分析方法，是使用五氟苯硫酚进行衍生化处理后通过GC/MS或HPLC/UV/MS分析。最近的研究表明，使用HPLC/MS方法无需复杂的衍生化步骤即可得到良好的结果；然而，该方法需约20到30 min的运行时间才获得目标分析杂质与API足够的分离度。

本文展示了使用具有亚2 μm UPLC色谱柱的UPLC/UV/MS分析苯磺酸、对甲苯磺酸以及它们的烷基酯的优势。结果表明，该方法无需柱前或柱后衍生，在仅5 min的分析时间内即可达到完全满足FDA和EMEA要求的灵敏度。

结果与讨论

通过方法筛选，快速开发出了分析苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的色谱方法，使用配备ACQUITY UPLC PDA检测器和SQ质谱检测器的ACQUITY UPLC系统。本方法在ESI+模式下采集MS数据，使用定时SIR功能最大限度地延长了驻留时间、从而最大化灵敏度。甲醇在5 min内从10%上升至98%的简单梯度实现了快速分离，并且所有分析物的分离度均为1.9或更好，同时分析灵敏度完全能够满足FDA和EMEA基因毒性杂质指南的要求。

UV检测

该方法在3 min内即可完成烷基磺酸酯标准品混合物（每种标准品浓度均为1 ppm）的分析，三次重复进样的UV色谱图（220 nm）如图1所示。所分析的烷基磺酸酯全部都表现出了好的线性，在校准曲线所覆盖的从0.01至10ppm的浓度范围内，其相关系数均大于0.9997。只要目标分析物能够与活性药物成分和制剂辅料完全分离，该方法的灵敏度就足以在FDA和EMEA指南要求的水平对药物和药品中的基因毒性杂质和潜在基因毒性杂质（PGI）进行监测。

采用本文所述的分析条件，进样10 μL标准品，通过UV检测所得的保留时间重现性、检测限和定量限如下表所示。0.04 ppm的LOQ对应药物或药品的1%溶液中4 ppm的定量限。该值完全能满足法规指南中对每日最大剂量为375 mg（或更低）的药品中PGI分析的灵敏度要求，适用于大多数市售药物。如果需要达到更高的灵敏度，可通过制备较高浓度（约5%）的样品和/或增大进样体积（约20 μL）达到所需的LOQ，但在这种情况下，可能需要采用MS检测以满足最高灵敏度的应用要求。

*全部浓度，N = 30

图1. 1 ppm的烷基磺酸酯标准品三次重复进样(10 μL)的UV检测(220 nm)谱图叠加结果。图中还示出了苯磺酸和对甲苯磺酸标准品(1 ppm)作为参比样品。

MS检测

图2示出了分析同一1 ppm烷基磺酸酯标准品所采集到的质谱数据(SIR模式)。通过UPLC，获得典型峰宽为1~3 s的窄峰，这要求快速MS扫描以确保对整个峰采集15~20个数据点，从而确保准确、可重现的积分和定量。定时SIR功能能够针对每种组分优化驻留时间和灵敏度，同时维持足够数据点的采集以获得良好积分结果。

所分析的烷基磺酸酯的MS数据全部都具有良好的线性，在校准曲线所覆盖的从0.01至3 ppm的浓度范围内，其相关系数均大于0.9960。6 ppb的LOQ（MTS）对应药物或药品1%溶液中0.6 ppm的定量限，这个值满足最大每日剂量为2500 mg（或更低）的药物产品所要求的灵敏度水平，适用于大部分市售药物。

对于分析难度极大的样品，可通过采用较高的样品浓度和较大的进样体积获得更高的灵敏度。

图2. 使用ESI+和SIR模式进行MS检测时，1 ppm烷基磺酸酯标准品三次重复进样（10 μL）所得的叠加谱图。图中还示出了苯磺酸和对甲苯磺酸标准品（1 ppm）作为参比样品。

苯磺酸氨氯地平（Amlodipine Besylate）

第一个示例是药物苯磺酸氨氯地平，它是氨氯地平的苯磺酸盐。如果这种物质在纯化/再结晶步骤中或通过任何其它来源接触到残留醇类，就有可能形成具有潜在基因毒性的苯磺酸醇酯类物质。该样品中未检测到苯磺酸甲酯（MBS）和苯磺酸乙酯（EBS）（含量低于0.2 ppm）。

制备第二份样品，其中加标浓度分别为15 ppm的苯磺酸甲酯和苯磺酸乙酯，对应于固体苯磺酸氨氯地平中基因毒性杂质法规要求限值的1/10。对此样品进行分析，六次重复进样所得的MS色谱图表明此色谱方法具有出色的灵敏度和重现性。该方法将目标分析物与游离磺酸分离，可确保磺酸酯的电离不受过量苯磺酸的抑制。定量MS结果展示了此方法的准确度和精度，其RSD为3.5%至8%，加标MBS和EBS组分的回收率分别为103%和122%。

加标15 ppm苯磺酸甲酯和苯磺酸乙酯的苯磺酸氨氯地平的MS分析。

只要药品的TTC水平足够高，且目标分析物能够与药物产品中的API、游离酸及制剂辅料完全分离，UV检测方法就能为这些药品的PGI分析提供足够的灵敏度。本实验采用UV检测（220 nm）分析加标了15 ppm MBS和EBS的苯磺酸氨氯地平样品，展示了目标分析物与苯磺酸、后洗脱流出的氨氯地平及样品中其它杂质的分离。实验结果表明，在这一特定样品中，UV检测能够达到FDA和EMEA对MBS和EBS检测水平的要求。

甲苯磺酸溴苄铵（Bretylium Tosylate）

第二个示例是甲苯磺酸溴苄铵这种药物，所对应的每种基因毒性杂质的TTC水平为0.5 ppm（按3 gm剂量）。MS数据所示，该样品中未检测到甲苯磺酸甲酯（MTS）和甲苯磺酸乙酯（ETS）（低于0.2 ppm）。

制备第二份样品，其中加标浓度分别为0.5 ppm的甲苯磺酸甲酯和甲苯磺酸乙酯，对应于固体甲苯磺酸溴苄铵中含有基因毒性杂质法规要求限值的1/10。对此样品进行分析，六次重复进样所得的色谱图表明此色谱方法具有出色的灵敏度和重现性。该方法将目标分析物与游离磺酸分离，可确保磺酸酯的电离不受过量甲苯磺酸的抑制。定量结果展示了此方法的准确度和精度，其RSD为4%至7%，加标MTS和ETS组分的回收率分别为94%和104%。

甲苯磺酸溴苄铵中烷基甲苯磺酸酯的分析。

本样品所得的UV数据说明了采用UV检测方法分析这类基因毒性杂质的局限性。与MS检测相比，UV检测固有的相对较低的灵敏度和专属性使其不适用于检测每日剂量较高因而要求高灵敏度的药品或药物，也不适用于检测无法与目标分析物完全色谱分离的药物或药品。溴苄铵在色谱中比氨氯地平洗脱早得多，其峰尾会拖延直至MTS和ETS洗脱区域，从而覆没这两种目标分析物。

此外，此分析所要求的TTC水平（API中0.5 ppm）低于UV方法的定量限。虽然通过增大浓度至5%、提高进样体积体积（20 μL）可在某种程度上提升灵敏度，但是，溴苄铵峰对分析物的干扰问题仍然存在。

总的来说，UPLC与使用SIR模式的MS检测，可为药物和药品中烷基磺酸酯的分析提供一种最灵敏、专属性最高的方法。尽管UV检测具有局限性，但是带UV检测的UPLC仍可成功用于许多药物化合物中GTI的分析，尤其对于那些每日最大剂量较低因此并不要求MS检测提供极高灵敏度的化合物来说更是如此。

结论

配备ACQUITY UPLC PDA检测器和SQ质谱检测器的ACQUITY UPLC系统为药物和药品基因毒性杂质监测过程中的烷基磺酸酯分析提供了完美的解决方案。UPLC分析可实现极高的分离度和通量，能够将多达30 min的分析时间缩短为仅5 min，因而在降低溶剂消耗量和减少溶剂废液生成的同时提升了实验室工作效率。

使用单四极杆质谱仪和单离子记录（SIR）方法可达到分析1~10%浓度的药物或药品中极低含量杂质所必需的专属性和灵敏度，能满足当今针对基因毒性杂质分析严格的法规要求。对于灵敏度和选择性要求不高的特定应用来说，UPLC与UV结合的检测方法是分析这类基因毒性杂质的一种简单且低成本的解决方案。

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