柱平衡——是必要步骤还是浪费时间？

上世纪七十年代，Flash自动柱层析系统已经应用到各个化学实验室当中，当时的实验证明，固定相硅胶基质需要提前润柱，将残留在硅胶中的气体赶走，从而使得溶剂能够更加均匀统一的流动，保证分离效果。现如今，全自动flash纯化系统已经普及开来，预装柱早已作为一个标准产品在实验室里广泛应用，很多时候我们也会遇到这样的疑问——是否还需要提前进行柱平衡呢？

我们来探讨一下柱平衡对色谱柱分离的影响。

在色谱柱分离中，这是一个最容易被经常拿来讨论和深究的话题之一，很多人在分离纯化之前都会进行很规范的柱平衡，但也有很多人并不做必要的柱平衡，一样也能得到很好的效果。那么哪种才是正确的呢，在我看来，这个也许视情况而定，取决于对产品的纯度要求以及目标化合物本身的特性。

首先，先解释一下，当流动相流经过干燥的固定相的时候，发生了什么。

1.      干燥活性硅胶，迅速吸收溶剂进入其孔隙当中和表面，尤其是一些极性溶剂，吸收更加明显。

2.      吸收过程中，溶剂将残留在孔隙中大空气赶跑，要将整个柱子里面的气泡全部排净，大约需要两到三个柱体积。

3.      柱平衡过程中，溶剂吸附到硅胶基质上面，会放出大量的热量，体系内温度会随之上升，很有可能流动相在这个过程中会达到沸点（流速越大，极性越高，产生的热量就越多），同时这个热量消散的速度也比较快，往往溶剂前沿部分热量最高，一个柱体积后即可回到室温。同时，温度上升也会导致在流动相接触到筛板的时候，会产生比较大的背压。

4.      当起始热量消散后，硅胶表面会继续吸收溶剂极性成分，柱平衡充分运行之后，吸收的极性溶剂成分也会慢慢的趋于平缓，例如：在乙酸乙酯和正己烷的体系当中，在充分的柱平衡过程中，色谱柱上下两端的乙酸乙酯的浓度的差异性会逐渐趋于相同。

以上我们阐述了在柱平衡过程中发生的一些现象。那么我们来想象一下，如果样品的纯化过程，没有进行柱平衡，那么会发生什么呢？

1.      不赶气泡，会不会产生气泡峰，影响检测效果，而且目标产物不可能在一个柱体积之内从色谱柱流出。

2.      溶剂和样品子硅胶中的吸收和交换都会产生热量，这些都会产生一些不好的影响：

·        柱压上升（热量产生越多，温度越高，压力越大），很有可能热量的散发使得压力超过最大柱压，甚至会将柱子损坏，这是一个值得我们注意的问题。另一方面，这样压力的增加，可能导致样品在柱内的沉积，不利于分离。

·        吸附/解吸的色谱动力学会因此改变，从而会产生一些未知问题，比如：馏分纯度低，分离度不够等。

·        如果您的样品是半挥发性的，这种情况下，热量的产生会导致样品的流失，产率降低。

可以发现，色谱分离当中，柱平衡非常关键，任何小小的变动都会影响最后的分离结果。特别是当遇到一个反应体系，本身已经带有一个非常低的产率和纯化效率的时候，这个现象尤其明显。

为了将柱平衡的影响在实际的实验效果中体现出来，我们做了一次对比实验，将五种组分的混合体系进行分离，在带有柱平衡和不带柱平衡的条件下进行对比。

实验条件

色谱柱：10 g Biotage® SNAP Ultra cartridge， 

上样量：100 mg (0.1 mL)，

梯度：5% 乙酸乙酯——40%乙酸乙酯，10CV（柱体积），

流速：36mL/min，

检测：200-400nm全波段扫描。

Figure 1. 带有柱平衡的色谱分离图

Figure 2. 未带有柱平衡的色谱分离图

两个对比图可以发现，带有柱平衡的分离色谱图明显优于不带柱平衡体系的效果，和带有柱平衡的效果相比，峰1已经被移平，同时峰宽增加，分离度也降低。

那么为什么会有这样如此大的不同呢，正如上文所说，当干硅胶（固定相）遇到溶剂（流动相）时，会放出的热量，溶剂会升温，这些热量会干扰亲脂性的样品（Rf> 0.5）在固定相中的吸附/解吸的动力学分配，从而影响分离效果。五种样品的Rf值见下表：

Table 1. 样品Rf值，条件：20%EtOAc in hexanes

Peak

Rf1

0.90

2

0.63

3

0.50

4

0.31

5

0.15

根据图谱可以发现，影响最大的还是峰1（Rf=0.9）

对于最后三个Rf小于0.5的样品而言，它们被有效的分离，但是从谱图来看，分离度，峰宽等仍然产生了一些影响。

根据以上的书我们可以发现，柱平衡的过程在Flash分离中的应用仍然是非常必要的，但是对比一些很资深的化学家而言，他们会经常省去柱平衡这一步骤，并且也得到了比较高纯度的产品，这些都是建立在丰富经验，同时对化合物非常了解的情况下。

对于我们而言，柱平衡是非常有必要的，宁可花少量的时间以保证更好的纯化效果，也不推荐大家省去柱平衡的时间，却产生了多余的不必要的一些分离隐患，得不偿失；毕竟磨刀不误砍柴工，您说呢？

对于Flash纯化，如您有更好的创意，欢迎您和我们联系。