利用qNMR进行早期自动效价测定的案例

在当今的小分子药物发现与研发环境中，相关公司必须谨慎地平衡风险与回报。在以往，分析化学家会在适当时间通过相关检测对研发过程（临床前，I至IV 期）提供支持。在每个阶段生成数据，以支持NCE（新化学实体）最终提交到监管机构审批。现在，后期临床试验投资动辄数亿美元，而根据经济学原理，在候选药物的潜能获得证明之前，只应对其进行最低额度的投资。因此，经完全验证的波谱法及其标准的研发通常因昂贵而耗时而拖延。效价测定作为阶段I前至关重要的一步，科学家正越来越多地转向定量核磁共振（qNMR）波谱来提供这一信息，而不是传统的HPLC。

早期开发所面临的挑战

关于分析化学家应如何对早期开发提供最佳支持的文章很多，例如，在《原料药和药品质量标准：分析方法的开发与验证》（2013，作者：Christopher M. Riley等）一书中，就对新药品质量标准设置要求与方法进行了严肃而全面的分析，其重点是分析方法的阶段性开发和验证。

此外，国际药物创新与质量联盟（IQ联盟，www.iqconsortium.org，一个由超过25家制药和生物技术公司组成的协会，其使命是推进基于科学并由科学驱动的全球性医药产品标准和法规）已经出版了一系列指南（《制药技术》，第36卷，第10期），探索并明确了在早期开发中应用良好制造规范（GMP）的行业通用方法与惯例。

以上报告以及许多其它报告，突出了从早期开发阶段的发现中选取一个有前景的候选样品作为原料药（DS），然后作为药品（DP）进入临床试验的复杂过程。在许多研究中，临床前安全性和毒性测试、制剂开发和首次使用所需的信息包中的关键部分正是准确的药物效价测定。

分析选项

效价是产生其最大效用的给定百分比所需的活性药物成分的剂量，而不考虑最大效用的具体大小。它通常通过HPLC测定，然而，直接测量需要有药物的标准品，这是大多数公司不会为早期化合物所承担的。另一种方法是通过以下减法计算来评估效价：

图1：药物产品中用于非活性化合物测定的分析方法

效价＝全部成分－∑非活性成分

其中非活性成分的总和（∑）包括：降解物质、过程杂质、水、残留溶剂和无机材料。图1显示了用于在测试制剂中测定各种非活性化合物的分析技术。

作为该减法规定的分析方法的一部分，经常还会进行各种并行测量，包括绝对化合物纯度评价、结构确证、残留溶剂、水分分析、相对响应因子计算。显然，，科学家们想寻找一种技术能一步到位，以实现简化和自动化，并降低分析成本。

如果不是HPLC，那么什么样的替代技术可以提供帮助呢？定量紫外-可见光分光光度测定法、定量红外光谱法，还是质谱法？

对于可能存在杂质的待表征药物，任何技术都必须是“快速”和具有选择性的，并且必须能在缺乏特定药物标准品的情况下进行定量分析。紫外-可见光分光光度测定法能做到快速，但它对杂质缺乏选择性，并且需要有特定药物的标准品。红外光谱法和质谱法可以对可能的杂质进行选择，但仍然需要有特定药物的标准品才能进行定量分析。

q-NMR能为这一问题提供理想的解决方案已成共识。qNMR效价测定已被证明是对一向会涉及多种实验和技术的常规开发测试的一种单点替代方案（参见参考文献1）。更重要的是，NMR还能提供结构信息，并证实同一实验中化合物的同一性。从监管的角度来看，传统的和定量的NMR是为国际药品注册协调会议（ICH）所接受的。

qNMR的唯一不足，是某些工作流程被认为需要专业知识和（或）训练有素的分析员以及详细的协议。

图2：一个典型的快速、自动化工作流所需的三个简单步骤，即样本制备、样本提交和自动数据分析与报告（PotencyMR，Bruker）

qNMR在实践中的应用

今天，新一代qNMR仪器、使用商用内部标准（IS）的工作流程，以及面向特定应用的软件已经使qNMR成为常规实验。在许多公司中，qNMR现在被作为一个“开放式访问”系统安装，所有化学家都可以使用。图2显示了一个典型的快速、自动化工作流所需的三个简单步骤，即样本制备、样本提交和自动数据分析与报告（PotencyMR，Bruker）。

这种自动化工具可确保便捷的样品提交（通过IconNMR自动化软件，Bruker）。优化的qNMR实验、以及最常用内部标准的参数均有提供。自动数据分析包括内部标准波峰识别，以及与先进“波峰捕捉”算法、分析物量化、一致性分析和效价计算的集成。根据定义分析物积分区域的SOP，可对工作流进行修改。

误差分析也自动包含在样品内，多分析物峰值的综合、平均以及RSD均能提供。在样品之间，可以提交复制样品。计算每个复制样品的效价，并报告最终的平均结果和任何相关的误差。

结果能以不同格式显示，如带光谱信息的PDF报告和Excel表输出。自动数据分析是基于NMR定量分析的成熟算法，这些算法可自动从采集模块中调用数据，也可手动执行。图3显示了使用300 MHz NMR仪器测量已知纯度的舒林酸样品的实例。

图3：使用300 MHz NMR仪器（应用相关商用内部标准IS）测量已知纯度的舒林酸样品的一个典型实验结果。IS与分析物完全独立。

结论

NMR毕竟是一种固有的定量技术，长期以来一直被用于定量分析应用。但只有在新系统和新自动化工作流可用的情况下，qNMR才能成为小分子开发组在早期效价测定上的可选方法。有趣的是，当监管机构要求相关公司在开发过程早期提供候选药物详细情况时，qNMR就已登场了，而经济压力正在推动既定行事方式的改变。这项技术已经获得了很大的进步，并且看起来其应用注定将变得更加广泛。

NMR 101

NMR依赖于特定原子核的一种性质，即它们会在特征频率下吸收、然后再释放电磁能量。给定同位素的通常响应频率的变化提供了它们的直接环境信息，包括来自邻近电子和磁性核的影响，从而可能推断分子身份、几何信息等。更重要的是，NMR信号也与样品中存在的自旋数量直接成正比。从而使NMR成为一种主要的比值定量分析法。

以下是对这一过程的粗略概括

样品制备

NMR通常只需很少的样品制备。对于液体NMR，可将材料溶解于合适的溶剂中。液体样品甚至可在自然状态下检测。而对于固体样品NMR，材料通常被包装进小直径圆柱形转子内。

样品导入

包含样品的薄壁玻璃管被置于由射频线圈和调谐电路组成的NMR探针内，而NMR探针又位于NMR波谱仪中心的强大磁体内。磁体使样品内的易感原子核与其磁场对齐，让它们保持一致的静息排列。NMR特别适用于含奇数个质子和（或）中子的原子核，例如1H或13C。这些核展现出一种内在的磁矩和角动量，它们共同赋予原子核一种被称为“自旋”的性质。足够强的磁体会使这些原子核与其磁场对齐。

数据采集

射频线圈以正确的频率释放一个或多个射频脉冲以扰动特定的核，然后检测在所谓的自由感应衰减（FID）过程中随着核“弛豫”回归静息排列所释放出的能量。由于FID信号相对于背景噪声可能相当小，所以通常进行多次采集，取平均值。然后通过傅立叶变换将该信号转换成NMR波谱，显示核的响应频率。

数据解读

表征完善的给定同位素响应频率差异揭示了相邻电子的电磁影响（“化学位移”）。将波峰分裂成多个亚峰表明相邻核的磁影响（“自旋耦合”），可提供有关的数量和几何信息。NMR信号也与样品中存在的自旋数量成正比。从而使NMR成为一种主要的比值定量分析法。定制的RF脉冲序列可以挖掘出某个样本中的具体细节，有时会探测多个核。高级软件可以简化分析和解读操作，并能使数据采集、分析和报告的许多方面实现自动化。

参考文献

1、Webster G.F.和Kumar S.；Anal Chem；86, 11474 (2014)

关于作者

1978年，Anklin博士就读于瑞士苏黎世的ETH，采集了他的第一批NMR波谱。他于1984年开始作为一名应用科学家，供职Bruker瑞士，四年后移居美国，直接参与了NMR应用发展的一些里程碑事件。目前，他在美国马萨诸塞州的Bruker Biospin担任副总裁。联系方式：Clemens.Anklin@bruker.com

布鲁克提供全球最丰富的NMR和EPR波谱仪及临床前影像MRI研究工具。选择创新，选择诚信和信念，选择布鲁克。