nanoVoxel 3000

高分辨显微CT

本研究中显微CT检测技术采用天津三英精密nanoVoxel 3000型，通过该技术可清晰呈现荧光通道的内在三维结构，即不同解剖部位中纤维结缔组织的固有纤维结构；如手和前臂皮肤通道中脂肪小叶间隔内的纤维主要沿流动方向纵向分布；血管外膜通道中纵向纤维集中分布于外膜基质的一侧；右心耳梳状肌表层组织纤维呈纵横交错分布。显微CT聚焦微米尺度，解析组织微观结构，为医学研究积淀技术底蕴，突破医学壁垒。

本研究共招募20名健康受试者，年龄23~37岁，其中男性 15 名、女性 5 名。排除标准：既往存在原发性或继发性肢体淋巴水肿、脂肪水肿，受试部位大面积瘢痕或皮肤病变，以及磁共振检查禁忌证。本研究已通过北京医院伦理委员会审批（批号：2016BJYYEC-066-02），所有受试者均在试验开始前签署知情同意书。 本研究选取手指 5 个井穴、手腕 1 个穴位、足趾 3 个井穴及踝关节 3 个穴位作为磁共振皮下注射位点。每个注射位点由两名受试者接受检测，左右足的选择由受试者自主决定。另有两名受试者先行接受前臂常规磁共振血管成像，成像完成后，选取一处靠近浅静脉、既非穴位也非经络循行部位的点位作为对照位点。 注射深度控制在皮下疏松结缔组织内约 1~2 mm 处。皮下注射顺磁性造影剂钆喷酸葡胺，注射剂量 0.2~0.5 mL，其浓度为156 mg/mL。 对自穴位延伸而出的液体传输通道进行扫描。

人体标本实验由中国医学科学院、北京协和医学院人体组织库提供支持，研究已通过伦理委员会审批（批号：2013BJYYEC-037-02）。本研究于 2016 年10 月至 2019 年 3 月期间，选取19 具仅经冷冻、未使用福尔马林浸泡的人体尸体。所有标本在实验前置于室温解冻。

首先对样本进行脱细胞处理，将样本置于 1 mol/L 氯化钠溶液中，室温摇床振荡 24 h；随后浸入正己烷溶液，室温振荡 24 h。其次用磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗样本，再放入 1% 十二烷基硫酸钠（SDS）溶液中，室温振荡 24 h。随后再次以 PBS 漂洗，将样本置于 0.5% 胰蛋白酶溶液内，室温振荡处理 2.5 h。样本经冷冻干燥 24 h 后，浸入质量分数 10% 硝酸银溶液避光浸泡 30 min；缓慢加入等体积的质量分数 3% 氢氧化钠溶液。反应 30 min 后，用去离子水轻柔漂洗样本，再次进行冷冻干燥。制备完成的样本于室温保存，待显微 CT 扫描。

所用显微CT设备为三英精密 nanoVoxel 3000 型高分辨率三维 X 射线显微 CT 。

为实现长距离液体传输通道可视化，本研究选取人体标本（1~10 号）右手拇指远端作为注射位点。使用 1 mL 注射器，于皮下 1~2 mm 处注射 0.3 mL 荧光素钠溶液（由生理盐水稀释，终浓度 10 g/L）。顺磁性造影剂钆喷酸葡胺与墨汁的注射操作，均与荧光素钠保持一致。连续观察扩散轨迹，待 2.5 小时后开展后续实验。随后采用全自动胸外按压仪，以每分钟 110 次的频率对心脏部位持续胸外按压 2.5 小时。在蓝紫光环境下用数码相机记录荧光示踪剂的解剖学分布，并分别采集荧光染色区域与对照区域的组织样本，用于后续检测。

另取 3 具人体标本（11、12、13 号），于右手拇指相同位点注射钆喷酸葡胺（0.5 mL，终浓度 156 mg/mL）。完成 2.5 小时反复胸外按压后，采用 1.5T 磁共振扫描仪搭配体线圈开展扫描。

剩余 2 具标本（14、15 号），在前述相同注射位点加压注射墨汁，对手部、前臂淋巴管进行显影，全程使用数码相机记录解剖过程。

向 2 具标本（16、17 号）右手拇指同一位点，注射 0.5 mL、粒径10 nm的量子点微球（CdSe/ZnS 核壳结构，表面修饰羧酸配体；发射波长 525 nm±5 nm；透射电镜测得粒径 11 nm±1 nm）。另 2 具标本（18、19 号）同位点注射 0.5 mL、粒径110 nm的量子点微球（CdSe/ZnS 核壳结构，表面修饰羧酸；发射波长 565 nm±10 nm；透射电镜测得粒径 110 nm±20 nm）。皮下注射完成后，使用全自动胸外按压仪以每分钟 110 次的频率，对心脏部位持续胸外按压 2.5 小时，在蓝紫光环境下用数码相机记录荧光示踪剂的解剖学分布。

分别从手部、前臂、上臂、腋窝及胸部的荧光染色组织中采集样本。按照标准流程，采用冷冻荧光染色、VG+弹力染色或苏木精-伊红 （H&E）染色对采集的组织样本进行组织学检查。使用墨水永久标记组织样本中荧光信号的确切位置。取样后，从含荧光信号路径的组织中切割出厚度为5-10微米的冷冻横切片，并在荧光显微镜下观察。随后对同一张冷冻切片载玻片分别采用苏木精-伊红（HE）以及VG+弹力染色法进行检测。所用组织样本与冰冻切片中的样本完全一致。采用TPLSM 系统对所有皮肤样本、血管及周围结缔组织样本进行检测。 TPLSM 的激发波长为960 nm，发射波长范围为495–630 nm。每个样本均以512×512分辨率、0.1 μm层厚采集了25个切片图像。

当注射位点为穴位时，可同时显示出皮肤通道与血管周围通道（图 1）。若注射点位于前臂或踝部皮下浅静脉附近，则仅能观察到血管周围通道（图 1A3）。这些皮肤通道位于皮下组织中，呈现“管腔内充盈缺损”的形态.（图 1A2、B、C、D、E、F2、G、H、I、J、K）。在不同横断面测量得出，皮肤通道的管腔直径约为 2.0~8.0 mm。血管周围通道对应前臂或小腿浅静脉，其管腔呈“光滑状（图 1A3）。这些数据与我们先前通过MRI在受试者身上获得的研究结果一致。结合实验经验可知，皮下注射钆喷酸葡胺后，发生造影剂强化的部位为静脉外膜，而非静脉管腔。所有手指远端均可同时显影皮肤通道与血管周围通道。因此，后续实验选取拇指远端作为皮下注射位点，该部位为手太阴肺经井穴，位于拇指指甲桡侧后方。

在蓝紫光环境中使用数码相机记录，结果清晰显示：在所有十名受试者（编号1-10）中，前2.5小时内仅注射点周围出现荧光素的局部扩散。经过后续2.5小时的反复胸外按压后，十名受试者中有七例出现了长距离荧光传输路径——这些路径起源于拇指注射点，延伸至右心房壁的浅表组织及右心耳的梳状肌，但其余受3名试者均未观察到此类现象，推测原因是另外 3 具因重度恶病质导致组织间质液含量不足，所以未出现此类通道。

这些荧光通道通常在手部和腕部皮肤上易于观察，而在前臂上部 及上臂皮肤处则向深层延伸并逐渐消失（图2F、H、I及图3A）。沿传输路径逐层解剖发现，手部与前臂的荧光通道由多种解剖结构构成，包括真皮、皮下组织、拇指肌腱与肌肉表面的浅筋膜，以及静脉周围的疏松结缔组织（图 2F、H、I）。

在肘窝、上臂及腋窝区域，仅头静脉、肱静脉周围的血管旁结缔组织与腋鞘出现荧光染色（图 2B、C）。剖开胸腔后可见，上腔静脉外壁、右心房壁表层组织及右心耳梳状肌均被荧光素明显染色（图 2L、K）。荧光素示踪显示的液体传输路径，与MRI检查中使用Gd- DTPA 对编号 11至13号三具人体尸体所获结果一致，其中 7 岁男性标本（13 号）的成像特征尤为典型。

远距离荧光传输路径既非血管也非淋巴管。首先，实验全程采集右心室腔及对侧肢体管腔中的血液，发现均未被荧光素染色，说明荧光液体并未流经血管管腔。其次，荧光路径的宽度远大于用墨水显影的血管及淋巴管（受试者编号14、15；图3A、B、E）。第三，手部及下臂区域荧光路径的构成成分包括真皮层、皮下组织以及肌肉或肌腱上的表层筋膜（图2G、H），所有这些结构均非管状结构。

持续按压 2.5 小时后，在 16~19 号标本的右手拇指远节指骨表层组织中，均可检出10 nm与110 nm两种粒径的量子点微球。其中仅 16、17 号标本的前臂部分静脉管壁处观察到 10 nm 量子点微球。相较于荧光素钠，10 nm 量子点微球所显影的血管外通道数量明显更少。本实验中，未在心房壁组织内检测到 10 nm 量子点微球。

分别采集手部、前臂皮肤，头静脉、腋鞘，以及右心房壁、右心耳梳状肌表层组织样本。依次采用冷冻荧光染色、VG-弹力染色和H&E染色法观察结果显示荧光通道的组织学结构以纤维结缔组织为主（图 1 G1-2、H1-2）。

采用 CD31、D2-40 免疫组化染色对纵向荧光通道横断面观察，未见连续的毛细血管管道结构（图 3 G1-4、H1-4）。TPLSM 结果显示，所有荧光通道样本沿流动方向均含有丰富的纵向纤维（图4E、J、O），这与我们先前在人类截肢下肢中的研究结果一致。本实验中未观察到荧光示踪液体流经动脉外膜的现象。

 借助显微 CT 技术，可清晰呈现荧光通道的三维固有结构（图 4C、D）。手部及前臂荧光皮肤通道中的小叶间隔被证实沿液体流动方向纵向分布（图 4D、F，图 4A、C、D）。与之相对，传输通道外侧的小叶间隔排列不规则（图 2E，图 4A、B）。静脉标本中，血管外膜纤维主要沿血管长轴分布；纤维在环形外膜内分布不均，且集中富集于血管外膜一侧（图 2A，图 4G、I），表明外膜中的液体沿外膜基质不均匀传输。通过显微 CT 与TPLSM 成像显示，右心耳梳状肌表层组织的内在结构由纵横交错的纤维构成（图 4L、M、N、O）。