客户文章 | Food Res Int. IF 8：风味组牵手微生物多样性，西北农林团队揭示米酒好喝的秘诀！

糜子稠酒是中国传统的发酵型养生米酒，富含多种营养与风味物质，赋予产品独特风格，尽管糜子稠酒香气多样性突出，但其发酵过程中微生物群落的演替规律及功能作用尚不明确。

糜子稠酒

理化指标、有机酸靶向代谢、风味组学、16S rRNA扩增子测序

发酵特性（pH、总酸、还原糖、淀粉、蛋白质含量）如图1所示。糜子稠酒pH从S1至S4阶段显著下降，S5阶段略有回升；总酸随发酵时间显著升高，S5阶段达9.89g/kg。这一变化与糖类转化为有机酸相关，有机酸积累导致pH降低、总酸升高。适宜的酸度可起到缓冲平衡作用，提升糜子稠酒的醇厚顺滑口感；酸度不足则不利于微生物生长代谢，影响酒品品质与稳定性。发酵过程中淀粉与蛋白质含量持续下降，S1至S5阶段，淀粉从665.93mg/g降至602.72mg/g，蛋白质从8.36g/100g降至7.36g/100g。淀粉与蛋白质是糜子籽粒的主要组分，作为微生物生长代谢的底物。微生物分泌的淀粉酶将淀粉水解为还原糖，还原糖进一步被微生物代谢为乙醇等物质。

α-淀粉酶活性在0小时（S1）至6小时（S2）保持稳定，随后下降。α-淀粉酶与糖化酶将谷物淀粉水解为还原糖，酿造前期还原糖浓度急剧升高。芽孢杆菌属是产α-淀粉酶的细菌属之一。蛋白酶与糖化酶活性在S2阶段达到峰值，随后全程下降，与已有研究结果一致。黄酒发酵过程中提升蛋白酶活性，可显著促进氨基酸生成，进而丰富成品酒的风味层次。

图1. 糜子稠酒发酵过程中发酵参数的动态变化

有机酸是酒类的核心风味物质，主要贡献酸味。酸度决定稠酒的酸感强度，协调风味、提升酒体醇厚饱满感。苹果酸、乳酸、柠檬酸、草酸、琥珀酸含量较高。已有研究表明，乳酸与乙酸是中国黄酒中最重要的有机酸。苹果酸源于三羧酸循环，酸味浓烈锐利，可作为风味调和剂。乳酸是糜子发酵的典型有机酸，随发酵时间持续升高，S5阶段达3537.13 ng/mg。乳酸与乙酸是发酵食品的主要代谢产物，主要通过糖酵解与磷酸酮醇途径生成。柠檬酸、草酸含量先升后降，琥珀酸、丙二酸含量持续上升。琥珀酸由苹果酸经酵母代谢生成，对心血管与肝脏具有潜在保健功效。S5阶段的苹果酸、乳酸、琥珀酸、富马酸含量与S1阶段差异显著，是糜子稠酒风味的关键贡献物质。

表1. 糜子稠酒发酵过程中有机酸化合物含量研究

风味特征（尤其是香气）直接决定发酵酒的整体感官品质。挥发性风味成分主要来源于原料、酒曲与发酵环境。采用 HS-SPME-GC-MS 分析糜子稠酒发酵过程中的挥发性代谢物谱。结果显示，酯类占挥发性物质总量的18.59%，其次为萜类、杂环类、酮类、醇类、醛类，上述物质合计占比超 74%。PCA分析显示，S3与S4样品聚类，S1、S2、S5样品明显分离，表明发酵后期发酵醪的风味物质差异较小，风味多样性主要形成于发酵前期。基于挥发性物质数据的OPLS-DA分析显示，200次置换检验得R²Y=0.99、Q²=0.925，证明模型稳定且预测性良好。

S2 vs S1、S3 vs S2组间差异代谢物数量更多，表明发酵前期反应最剧烈。这些差异代谢物以酯类、萜类、酮类、醇类为主，是糜子稠酒风味的主要贡献物质。KEGG分析显示，挥发性差异代谢物的三大富集通路为氨基酸合成与代谢、萜类生物合成、碳水化合物代谢。发酵前12小时（S1~S3）以淀粉、蛋白质等大分子降解为主；发酵后期则进行倍半萜、三萜、单萜的生物合成，赋予糜子稠酒独特风味，与已有研究结果一致。值得注意的是，α-亚麻酸代谢在三组比较中均显著富集，该通路与脂质调节、免疫增强功能相关。

图2. 糜子稠酒发酵过程中挥发性风味化合物的变化

对差异代谢物进行感官风味注释，以雷达图展示注释数量前十的感官风味。结果显示，不同发酵阶段风味差异显著，果香、浆果香、甜香、青草香、木香、苹果香的差异具有统计学意义。基于前十种感官风味绘制差异风味代谢物热图，这些代谢物主要分为萜类、酯类、醛类、酸类、醇类、酮类、杂环类。其中萜类代谢物数量最多，对糜子稠酒风味贡献突出。

萜类不仅是提供香气与口感的微量成分，还具有保健功效，其生物活性备受关注。本研究中，仅反式-β-法尼烯、顺式-β-法尼烯、(-)-桃金娘醇、2-异亚丙基-5-甲基环己酮、L-莰烯在发酵末期含量升高，多数萜类物质含量下降，于S3阶段达到峰值。共检测到15种酯类物质，其中8种在S5阶段含量更高，这也是S5相较于S4果香、甜香更突出的原因。酯类常作为白酒品质指标，是清香型白酒的核心香气来源。白酒中高比例的醛类赋予其独特酱香，提升产品特色。糜子稠酒中5种醛类物质含量整体下降，仅反式-4-癸烯醛含量升高，与酱香型白酒规律不同。酸类对白酒风味形成至关重要，适宜的酸度可在饮用时起到缓冲作用，储存过程中逐步生成香气酯类。本研究中5种酸类物质含量显著升高，为糜子稠酒带来果香、脂肪香、奶酪香、蜡香、油香。苯乙醇是中国黄酒的核心香气物质，具玫瑰蜜香，在本研究中于S4阶段达到最高值。

图3. 糜子稠酒发酵过程中香气属性的变化

发酵食品品质由原料与微生物代谢活动决定，因此本研究通过测序分析发酵过程中的微生物多样性。PCA结果显示，S2与S3阶段明显分离，表明发酵前6小时进程迅速；S3、S4、S5阶段几乎重叠，说明发酵6小时后微生物群落结构趋于稳定。各发酵阶段特有ASV数量分别为118、226、77、56、73，而5个阶段共有的ASV仅12个，表明糜子稠酒发酵过程中微生物群落变化显著。

采用Chao、Shannon、Simpson指数评估细菌α多样性。Chao指数先升后降，S1、S2阶段显著高于S3、S4、S5阶段；Shannon多样性指数变化趋势与Chao指数一致。该结果与PCA结果相符，证明发酵前12小时（S3阶段）反应剧烈、微生物多样性高。S3阶段乳酸大量积累形成酸胁迫，不利于酸敏感菌生长；同时S2阶段酶活达峰值，加速淀粉与蛋白质水解，导致S3阶段底物消耗，限制微生物增殖。这些因素共同导致S2阶段后微生物多样性下降。

图4. 糜子稠酒发酵过程中微生物多样性分析

门水平上，糜子稠酒细菌以厚壁菌门为主，五个阶段平均相对丰度分别为 62%、64%、99%、100%、100%，与已有研究结果一致。发酵前期，变形菌门占比小，随发酵进行，厚壁菌门丰度升高，变形菌门丰度降低。厚壁菌门环境耐受性强，成为糜子稠酒发酵过程中的优势微生物。

属水平上，乳杆菌属在五个阶段均占优势，相对丰度随发酵阶段升高，S4阶段达99%。S1~S2阶段，芽孢杆菌属也是主要菌群。芽孢杆菌属广泛存在于各类发酵食品中，是糯米酒、苦荞酒中的核心微生物。作为功能微生物，芽孢杆菌可分泌多种水解酶（淀粉酶、酸性蛋白酶、纤溶酶等），助力米酒风味形成。发酵后期酒精含量升高、氧气浓度降低，芽孢杆菌无法生长。已有研究表明，中国浓香白酒发酵的优势细菌属包括乳杆菌属、芽孢杆菌属、魏斯氏菌属、瘤胃球菌属，其中乳杆菌属为最优势菌属，主导发酵后期细菌群落演替。因此，糜子稠酒的发酵特性与中国浓香白酒相似。

通过LEfSe分析（LDA>4）鉴定糜子稠酒各发酵阶段的生物标志物。S1阶段富集变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌科、芽孢杆菌属；S2阶段的标志物为梭菌纲、优杆菌目、链球菌科、伯克霍尔德菌目；S4阶段的标志物为厚壁菌门；S5阶段的标志物为乳杆菌属、芽孢杆菌纲。结果表明，糜子稠酒发酵前期菌群更丰富，后期以乳酸菌为主，与前期研究结果一致。

图5. 糜子稠酒发酵过程中微生物群落结构差异

采用方差分解分析（VPA）探究影响糜子稠酒发酵微生物群落形成的关键非生物因子，将环境因子分为发酵参数与有机酸两类，明确不同变量类型对微生物群落的贡献度。结果显示，有机酸是驱动微生物群落形成的核心因子，解释度达 85.6762%。有机酸积累可改变环境pH、抑制酸敏感菌生长，进而调控糜子稠酒各发酵阶段的微生物群落结构。

基于前20大微生物菌属的斯皮尔曼相关系数（|r|>0.6，p<0.05）构建共发生网络，分析糜子稠酒中微生物间的关联。厚壁菌门的节点数、边数与平均度均高于其他菌门，表明厚壁菌门群落内部互作更强。共发生网络显示，边连接节点数前五的菌属为乳杆菌属（18）、梭菌属（18）、肠球菌属（17）、嗜血杆菌属（17）、韦荣球菌属（17）。优势菌属乳杆菌属与其他微生物呈负相关，说明其丰度可抑制其他重要细菌的生长。乳杆菌属可通过两类碳水化合物发酵途径生成乳酸与乙酸，发酵环境中有机酸积累形成酸胁迫，抑制耐酸性较弱的微生物生长，最终形成以耐酸乳杆菌属为主的稳定微生物群落。武夷红曲糯米酒发酵末期，乳杆菌属成为优势菌种，这一现象在发酵食品中普遍存在，源于其耐低pH特性，且可分泌细菌素等抑菌物质，抑制酿造过程中多种微生物（尤其是致病菌与腐败菌）的生长。

采用Mantel检验与RDA分析，明确影响糜子稠酒发酵微生物群落演替的理化参数。各发酵参数与有机酸均与微生物群落结构显著相关，其中酸相关变量相关性最强。乳酸与己酸、丁酸、富马酸、pH呈负相关。已有研究发现，己酸积累会抑制乳酸生成，窖泥中己酸含量随时间升高、乳酸含量降低。相较于S1、S2阶段，S3、S4、S5样品的细菌群落在坐标系中更聚集，表明发酵后期微生物稳定性提升。

发酵参数中，淀粉（R²=0.79，p=0.001）、α-淀粉酶活性（R²=0.80，p=0.001）、总酸（R²=0.77，p=0.001）、蛋白质（R²=0.73，p=0.001）、pH（R²=0.63，p=0.003）与微生物群落结构显著相关。有机酸中，己酸（R²=0.91，p=0.001）、苹果酸（R²=0.86，p=0.001）、丁酸（R²=0.70，p=0.002）、丙二酸（R²=0.60，p=0.003）、乳酸（R²=0.46，p=0.022）与微生物群落结构显著相关。己酸、苹果酸、丁酸与芽孢杆菌属、肠杆菌属、未分类蓝细菌门、肠球菌属、未分类肠杆菌科、克雷伯氏菌属呈正相关；丙二酸、乳酸、总酸与S5阶段优势微生物（乳杆菌属）呈正相关。有机酸积累与总酸升高，使微生物菌群向耐酸性方向演替。综上，有机酸是糜子稠酒发酵过程中微生物演替的核心驱动因子。

发酵过程中形成的风味物质主要由参与代谢的微生物产生。基于斯皮尔曼相关系数绘制热图，分析发酵过程中优势菌群（前10大细菌属）与风味差异代谢物的潜在关联。发酵中后期优势菌属乳杆菌属与萜类、酸类、杂环类物质呈强正相关，证明其是糜子稠酒滋味与风味形成的核心菌群。乳杆菌属在各类发酵食品中可生成挥发性风味物质与有机酸（尤其是乳酸），例如参与传统高粱酒、酸鱼中酯类的合成。而在糜子稠酒中，乳杆菌属主要促进萜类物质生成，萜类贡献木香、甜香、青草香。因此，糜子稠酒的风味从前期果香为主，转变为后期以乳杆菌属主导的萜类木香为主，与香气特征分析结果一致，证明微生物群落演替直接影响香气轮廓。

芽孢杆菌属、肠杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、未分类肠杆菌科、罗斯氏菌属、肠球菌属、未分类蓝细菌门、克雷伯氏菌属与5种醛类物质呈显著正相关。芽孢杆菌属与醛类呈正相关符合预期，已有研究证实芽孢杆菌可合成多种酶类（淀粉酶、蛋白酶）及醛类合成相关酶（香草醛酶）。5种醛类物质中，反式和顺式-2,4-癸二烯异构体与甲硫基丙醛的气味活性值（rOAV）均大于1，贡献发酵前期糜子稠酒的果香、青草香、浆果香。芽孢杆菌可生成多种醇类、有机酸、脂肪酸酯，同时与(Z)-4-癸烯酸甲酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸-(Z)-3-己烯酯（酯类）、2-己醇（醇类）呈正相关。肠球菌属可产生酯酶，是多种发酵过程中（尤其是酯类）的核心产香菌，因此与 (Z)-4-癸烯酸甲酯（rOAV>1）、(E)-2-甲基-2-丁烯酸-(Z)-3-己烯酯、乙酸壬酯呈正相关。

图6. 糜子稠酒发酵过程中的微生物群落组成及共现模式

图7. 糜子稠酒发酵过程中优势微生物物种（前10名）与关键挥发性化合物的Spearman秩相关性热图分析

本研究系统监测了糜子稠酒发酵过程中微生物群落演替、理化特性与挥发性代谢物的动态变化。发酵过程中，总酸与还原糖含量升高，淀粉与蛋白质含量降低；淀粉酶、蛋白酶活性在S2阶段达到峰值。糜子稠酒中苹果酸、乳酸、柠檬酸、草酸、琥珀酸含量较高；萜类、酯类、醛类是发酵过程中贡献香气的主要挥发性差异代谢物。发酵前期，乳杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属为优势细菌属；发酵后期，群落向耐酸性方向演替，乳杆菌属成为绝对优势菌属。相关性分析显示，乳杆菌属可促进萜类与酸类物质生成，其余9种优势细菌属则可促进醛类物质合成。后续研究可通过添加一种或多种核心细菌，调控糜子稠酒发酵过程中风味代谢物的积累。本研究结果为糜子稠酒发酵工艺的优化与产业发展提供了参考数据。

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