寡核苷酸酶法合成技术全景解析：传统与创新的协同进化

2026-04-27 09:32:04, Zhiying/Kangyang Cytiva（思拓凡)

寡核苷酸作为核酸药物、基因编辑、分子诊断的核心原料，其合成技术的迭代直接推动生物医药领域的发展。固相载体合成（SPOS）作为经典技术奠定了产业基础，而酶法合成凭借绿色高效、长链合成优势成为新一代技术方向。

Cytiva与上海兆维科技深耕寡核苷酸合成领域，从传统工艺优化到酶法技术创新，共同探索产业升级路径，本文为你全面解析寡核苷酸酶法合成技术的现状与未来。

经典基石

固相载体合成的核心价值

固相载体合成（SPOS）作为寡核苷酸合成的第一代核心技术，凭借成熟的工艺体系成为当前产业应用的主流，其核心优势突出：

工艺成熟且标准化：

亚磷酰胺法为基础的SPOS技术经过数十年优化，合成流程、质量控制体系高度标准化，适配规模化工业生产，是短链寡核苷酸合成的首选方案。

底物兼容性强：

可高效适配各类修饰核苷（如2''-OMe、2''-F、硫代磷酸酯等），满足核酸药物的多样化修饰需求，是修饰型寡核苷酸合成的核心技术支撑。

产率稳定且成本可控：

短链合成中步骤收率可达99%以上，设备与试剂体系产业化配套完善，规模化生产下成本优势显著。

质控体系完善：

针对合成杂质的分离、检测方法成熟，可严格满足药品生产质量管理规范（GMP）要求，目前已支撑多款核酸药物成功上市。

创新浪潮

酶法合成的技术体系与全球应用

酶法合成以温和的水相反应体系、高原子经济性、长链合成优势成为研究热点，主要包括从头酶合成和酶法拼接（酶连接）两类。

从头酶合成：TdT酶为核心，实现从头合成

酶法发展稍晚于化学合成，研究者们先后发现了多核苷酸磷酸化酶，PNPase和T4 RNA聚合酶，用于RNA合成；在DNA合成领域，1959年发现了末端脱氧核糖核酸转移酶TdT，可实现不依赖于模板的DNA合成，以及模板依赖的9°N和KOD聚合酶，通过瞬时配对或self-priming的发夹结构来实现链延伸。出于合成效率、引发剂的偏好等原因，在从头酶合成领域，TdT路线以末端脱氧核苷酸转移酶为核心催化剂，无需模板即可实现脱氧核苷酸的从头聚合，是当前酶法合成的主流技术，主要分为3′终止法、TdT-dNTP conjugate、无终止剂法三种工艺。

核心工艺与特性

3′终止法：

最广泛的技术，通过可逆终止子（RT）封闭dNTP的3′-OH，实现单步碱基精准插入，脱保护后进入下一轮合成，主流RT包括氨基烷氧基、磷酸基、叠氮甲基等，脱保护机制各有不同（如氨基烷基通过亚硝酸盐进行脱保护，磷酸基则用碱性磷酸酶或焦磷酸酶，可实现全酶反应）。

TdT-dNTP conjugate：

通过一个可切割的linker将dNTP的碱基端共价连接到天然的TdT酶上。共轭结构让酶与底物之间保持恒定的空间邻近，从而促进快速的催化加成反应。酶提供的位阻效应可以确保每轮循环只添加单个核苷酸。这种方式的优势在于不需要对TdT进行大量的工程化改造，缺点在于linker切割时会对oligo链有一定的损伤，需要额外的步骤去恢复。

无终止剂法：

使用腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase）降解dNTP的三磷酸基团，或者用笼状分子螯合TdT催化必需的金属离子，从而有效终止每轮碱基添加循环。这种方式的优势在于不需要改造酶或者对底物进行修饰，可以充分发挥天然TdT酶高效快速的加成反应特性，实现超长寡核苷酸的快速合成。缺点在于容易在单轮循环中添加多个重复碱基，需要额外的检查纠错步骤。

	3′终止法	TdT-dNTP conjugate	无终止剂法
dNTP修饰	是	是	否
TdT 需要工程化改造	是	否	否
是否需要其他试剂	否	是（需要可切割的linker）	是（Apyrase或caging molecule）
不足	TdT酶改造	linker切割会给oligo带来损伤	需额外的纠错步骤

基于TdT的三种从头酶合成路线的对比

从头酶合成的技术路线虽然优势众多，但其发展受酶催化效率限制，大多集中在科研端，且合成规模较小。

酶法拼接：酶连接为核心，传统与创新的融合

酶法拼接的核心思路为：先通过SPOS合成短片段寡核苷酸，再利用连接酶（DNA/RNA连接酶）将短片段精准连接为长链，实现“短片段化学合成+长片段酶法拼接”的协同，代表技术包括Almac BOOST技术、上海兆维科技短片段连接技术等。

核心工艺与特性

Almac 3-2-3-2 BOOST技术：

以3个Blockmer起始，随后连接成2条部分互补的单链oligo，并留出悬垂端（overhang）；悬垂端作为模板，用于下一轮退火与拼接；交替连接两条寡核苷酸链；通过多轮拼接，最终形成目标双链siRNA。Blockmer通过化学合成，5’端磷酸化由PNK酶（多聚核苷酸激酶）催化，短片段通过悬垂段的互补配对，在RNA连接酶的催化下延长。

（图片来源：ACS Chemical Biology 2023 18 (10), 2183-2187）

优势：

① 反应体系中最多只含有3个blockmers，避免副反应和杂质的累积。

② 多个QC points，每一步都可以检测反应情况，确保在加入下一个blockmer之前，每个拼接步骤都完全反应，提高合成可靠性。

上海兆维科技短片段连接技术：

针对siRNA、sgRNA等核酸药物，将目标序列拆分为数个短片段，通过杂交形成粘性末端，利用DNA/RNA连接酶催化连接，结合UF/DF（超滤/渗滤）、HPLC纯化，实现高纯度长链合成。

（图片来源：兆维公众号）

酶法拼接拥有非常高的oligo片段转化率，拼接过程几乎不产生新的杂质，下游纯化流程得以简化。上海兆维科技已通过酶法技术实现临床级核酸药物原料合成，助力两款药物候选物获IND批准。

技术协同

Cytiva × 上海兆维科技的寡核苷酸合成解决方案

Cytiva与上海兆维科技深耕寡核苷酸合成领域，分别从工艺平台与设备、酶法技术与产业化出发，为客户提供从实验室研发到工业生产的全链条解决方案，推动传统固相合成与创新酶法合成的协同应用。

Cytiva：寡核苷酸合成全流程工艺与设备支撑

Cytiva作为全球生物制药工艺解决方案提供商，为寡核苷酸合成提供从原料、合成设备到下游纯化的全链条技术支撑：

固相合成体系：

提供高纯度合成单体、固相载体、合成柱，优化亚磷酰胺法的耦合效率与修饰兼容性，适配GMP级短链寡核苷酸生产。

酶法合成配套：

提供温度控制精准的反应设备，适配酶法合成的温和反应需求；多样的纯化选择，适配简化的下游处理方案。针对酶法拼接不同步骤的杂质特性（酶、未连接片段、缓冲液添加剂等），提供各类材质和截留分子量超滤膜包、及匹配的硬件设备，实现杂质的高效去除，满足药品质控要求。

（Cytiva酶拼接整体解决方案，C2P）

工艺优化经验：

结合多年生物制药工艺经验，提供灵活的寡核苷酸合成纯化方案，同时支持固相合成与酶法拼接。

上海兆维科技（Hongene）：寡核苷酸酶法合成产业化核心技术

上海兆维科技作为国内核酸药物原料合成的领军企业之一，聚焦酶法拼接技术的产业化应用，为客户提供临床级长链寡核苷酸的酶法合成服务与技术解决方案：

核心酶法技术：

成熟的siRNA、sgRNA、exRNA等长链寡核苷酸酶法连接合成技术，产物纯度＞96%，适配核酸药物的临床前研发与中试生产。

定制化合成服务：

提供修饰型寡核苷酸的定制化合成，兼容2''-OMe、2''-F、硫代磷酸酯、GalNAc等多种修饰，满足不同核酸药物的研发需求。

工艺降本方案：

开发C2P、C2C酶法合成方案，省去过柱纯化步骤，大幅降低长链寡核苷酸的生产成本，推动核酸药物的规模化应用。

质控体系：

建立符合GMP要求的质量控制体系，针对酶法合成产物的杂质进行严格检测，确保产物符合药品研发与生产的质控标准。

未来展望

传统与创新的双向赋能

寡核苷酸合成技术的发展并非“非此即彼”，而是固相载体合成与酶法合成的双向赋能：

SPOS作为成熟技术，将继续支撑短链、修饰型寡核苷酸的规模化生产；
酶法合成将聚焦长链、复杂序列寡核苷酸的合成，弥补SPOS的技术短板，
而酶法拼接则实现了两者的有机融合，成为当前核酸药物产业化的最优解之一。

未来，随着酶工程技术的进步、可逆终止子的优化、合成工艺的整合，酶法合成将进一步提升修饰兼容性、合成精度、规模化效率，而Cytiva与上海兆维科技也将继续深化合作，从工艺平台、设备优化、技术产业化出发，共同推动寡核苷酸合成技术的升级，为核酸药物、基因编辑、分子诊断等领域的发展提供核心原料支撑，助力生物医药产业的创新突破。

（图片来源：Nature Communications | ( 2024) 15:8009）

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参考文献

1. Nanfeng Gao, Aimiao Yu, Weikang Yang, et al. Enzymatic de novo oligonucleotide synthesis: Emerging techniques and advancements. Biotechnology Advances 82, 108604 (2025). https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2025.108604.

2. Stephanie Paul, Darren Gray, Jill Caswell et al. Convergent Biocatalytic Mediated Synthesis of siRNA. ACS Chemical Biology 18, 10 (2023), 2183-2187. https://doi.org/10.1021/acschembio.3c00071.

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