北京友谊医院合作成果：高内涵成像揭示溶瘤病毒治疗乳腺癌、下咽癌类器官精准新策略

癌症仍然是全球主要的死亡因素，其中乳腺癌与下咽癌是威胁人类健康的重大恶性肿瘤，其治疗面临多重挑战，这类癌症的治疗是亟待解决的生物医学问题^[1–3]。在癌症治疗中，溶瘤病毒疗法（Oncolytic Virotherapy，OV）因其独特的抗肿瘤机制成为新兴研究方向。OV 疗法主要是通过在肿瘤细胞内复制后溶解肿瘤细胞，达到治疗的目的；此外，溶瘤病毒结合基因改造可补充免疫疗法中的抗肿瘤的机制^[4-6]，重塑肿瘤微环境并激活系统性抗肿瘤免疫。改造的 OV 中添加核酸片段或短发夹 RNA（shRNA）片段，这些片段可调节肿瘤微环境中蛋白质表达，以达到杀死肿瘤或增强抗肿瘤免疫反应^[7-9]。

本研究利用开发的新型重组肿瘤溶解腺病毒（AD4-GHPE），该病毒携带 PD-L1-shRNA 和 GM-CSF 序列，可降低肿瘤细胞中程序性死亡配体 1（PD-L1）的表达以增强T细胞免疫反应，分泌 GM-CSF 可发挥抗肿瘤活性，并靶向肿瘤。但其疗效仍受限于肿瘤异质性与患者个体化响应差异，传统 2D 细胞模型无法模拟肿瘤三维微环境，动物模型则存在种属差异大、通量低等问题，导致药物筛选效率低下，临床转化滞后。

高内涵技术的引入，为这一困境提供了破局之道。通过高内涵与溶瘤病毒抗肿瘤疗法结合后，可在实验中同步获取细胞形态、时空信息、蛋白表达等多维度数据。本研究借助了 ImageXpress^® Micro confocal 共聚焦高内涵系统（Molecular Devices），对两种在患者来源的乳腺癌和下咽喉类器官（PDO）模型进行了可视化的 Z 轴成像，通过多通道的图像采集，获取了类器官标志物的表达情况，高效的评价了类器官具有的原发肿瘤的组织学特征，验证了两种 PDOs 建模的有效性。在溶瘤病毒功能评估中，利用 SpectraMax i3X 酶标仪（Molecular Devices）检测了类器官中细胞活力情况，验证了溶瘤病毒对两种 PDOs 具有肿瘤杀伤效应。同时，利用高内涵以及 IN Carta AI 图像分析软件，通过 Z 轴的 3D 成像手段，用 AI 识别采集的每个类器官，精准分析了类器官中不同荧光通道下荧光表达强弱，证明了溶瘤病毒降低了 PD-L1 的表达情况。在这里高内涵技术与 AI 图像分析技术的有效结合，实现了类器官模型中 3D 共聚焦成像与分析，为患者来源的类器官建模与鉴定，研究溶瘤病毒对肿瘤杀伤效应提供高效、多角度的评价方案，这将为患者个体化治疗提供精准方案，也为肿瘤溶解病毒的开发提供工业化和标准化的提供研究思路。

• PDOs 培养：用于实验的患者来源类器官（PDOs）的样本取自医院手术患者的肿瘤组织及邻近正常组织，经病理学家评估，这些样本被确认为肿瘤组织。所有涉及人体样本的实验均已获得相关伦理委员会的批准。培养时将肿瘤组织样品切成小块，加入含有 1mg/mL Ⅳ 型胶原酶的 DMEM/F12 培养基中，在 37°C 摇晃消化。再将样品通过 70μm 细胞滤网过滤，800rpm 离心 5 分钟以收集细胞，将 1×10⁵ 个分离的细胞加入到 70μL 的培养基和基质胶（3:4）混合液中，并加入到 24 孔板的中心。随后加入 500μL 相应的培养基，对细胞进行培养。

• 溶瘤病毒 AD4-GHPE：将含有腺病毒 4 型完整基因组的质粒 pBR322-Ad4–WT 进行酶切和修饰。在反向末端重复序列（ITR）上添加巨细胞病毒（CMV）启动子控制的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因。人端粒酶启动子（TERTp）代替删除的原始 E1A 启动子。删除部分 E3 区序列被，并添加了一个 SpeI 单酶切位点，将 H1 启动子控制的 shPD-L1 RNA 序列插入 SpeI 酶切位点。通过乙醇回收的 DNA 片段后，将构建体转染到 AD293 细胞中扩增，当转染细胞变得肿胀、变圆，显示出细胞病变效应（CPE）时，收集细胞并进行三次冻融循环。离心后，将含有病毒原液的上清液转移 A549 细胞中进行扩增，当细胞中出现 CPE 时，收集细胞并再次进行三次冻融循环，以备后续感染实验。

去除培养好的类器官培养基，在 4℃、400×g 的条件下离心以去除基质胶。用 4% 多聚甲醛、Triton X-100、牛血清白蛋白（BSA）和 Tween-20 依次处理类器官，并与一抗孵育 6 小时。一抗包括：抗人表皮生长因子受体 2（HER-2）、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、α-微管蛋白（α-tubulin）和程序性死亡配体 1（PD-L1）、抗 P63 和角蛋白 5（KRT-5）的抗体。一抗孵育洗涤后，加入荧光标记的二抗和 DAPI 染色，清洗后放入到 96 孔板中用于检测。

使用 ImageXpress^® Micro confocal 共聚焦高内涵系统，通过多种荧光通道采集类器官图像，使用 10X 或 20X 物镜设备自动对焦后，采用 Z 轴层扫，间隔设置为 5 μm，层扫 100-200 μm，获取 3D 图像，做 2D 最大投影图像。MetaXpress 软件保存所有免疫荧光图像后，保存为 IN Carta 图像分析软件兼容的格式。

使用 IN Carta 图像分析软件可以分析溶瘤病毒处理两种 PDOs 多种参数。基于深度学习的图像分割模块 SINAP，在软件已有的训练类器官的基础模块上，以微调模式再进行 200 个轮次的训练，建立符合该实验的自定义模型，精确分割不同处理下 PDOs 的每个球体状形态。可以统计到每个类器官形态参数，包括面积、直径、圆度形态参数等，以及类器官上 PD-L1 和 α-tubulin 蛋白的平均荧光强度、最大荧光强度等多荧光通道的荧光。

在体外肿瘤杀伤试验 PDO 解离后，将每孔 5000 个细胞与 40% 的培养基和 60% 的基质胶混合，并以 10 微升为单位加入到 96 孔板中。基质胶凝固后，加入 100 微升新鲜生长培养基，继续培养 48 小时，直至类器官恢复球形。48 小时后，将培养基更换为含有特定剂量病毒的新鲜培养基。96 小时后，利用 SpectraMax i3X 酶标仪使用 CellTiter-Glo 评估溶瘤病毒处理后类器官的细胞活性。

从患者的手术来源的样品中培养了乳腺肿瘤类器官、下咽癌类器官以及肿瘤附近的正常组织类器官。为了确认类器官的来源和肿瘤特征，采用免疫荧光染色法，利用高内涵检测了两种肿瘤类器官中特定肿瘤标志物^[10-11]的表达情况。结果显示，在乳腺癌类器官中，人表皮生长因子受体-2（HER-2）和雌激素受体（ER）表现出较强的免疫反应性，而孕激素受体（PR）的表达较低，这与原发性乳腺癌的表型一致（图 1a）。在下咽癌类器官中，肿瘤基底细胞可被肿瘤蛋白 63（P63）和角蛋白 5（KRT5）标记，α-微管蛋白（α-tubulin）非特异性地标记整个结构，这与原发性下咽癌的表型相匹配（图 1b），通过对标志物蛋白的识别，可证明类器官的肿瘤特征。

在溶瘤病毒杀伤肿瘤时，进入肿瘤细胞质中通过酶将 shRNA 加工成小干扰 RNA（siRNA），该 siRNA 通过沉默 mRNA 来干扰蛋白质合成，可降低肿瘤细胞中 PD-L1 的表达，可调控肿瘤微环境中免疫反应。利用高内涵采集溶瘤病毒处理两种 PDOs 后 2D 最大投影图像，分通道显示了 PD-L1（绿色）和 α-tubulin（红色）在类器官中的荧光分布情况，直观的看到乳腺癌类器官和下咽癌类器官对照组中绿色荧光较强，而在溶瘤病毒 AD4-GHPE 处理后，绿色荧光下降（图 2a, 2b）。

为了更准确的提高 PDOs 的识别情况，避免多个类器官密集分布以及杂质影响图像的分割，使用类器官的明场（TL）获取的图像作为类器官分割的模型。利用 IN Carta 图像分析软件 SINAP 深度学习模型，训练 TL 通道的 2D 最佳投影图像，在已有的类器官模型基础上，通过微调训练集 200 个轮次的训练，建立符合该实验的 SINAP 模型，建立对应的掩码，精确分割不同处理下 PDOs 的每个球体状形态（图 3a）。通过类器官明场图像分割后的掩码，分别获得类器官的形态参数以及类器官内绿色和红色荧光的强度的参数信息（表 1），根据绿色和红色荧光平均荧光强度比值，可计算溶瘤病毒下调类器官内的 PD-L1 的蛋白表达情况（图 3b）。

利用化学发光试剂盒 CellTiter-Glo，基于溶瘤病毒处理类器官后，通过萤光素在活细胞的 ATP 的参与下，被萤光素酶氧化，产生发光，通过 SpectraMax i3X 酶标仪检测活细胞内 ATP 的发光信号，利用软件 SoftMax Pro 可以检测与对照组相比，溶瘤病毒处理下肿瘤细胞活力受到影响（图 4）。

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