应用说明 | 使用 3D 细胞球模型监测 T 细胞侵袭实验

简介

T细胞疗法旨在帮助我们的免疫系统清除癌细胞。这些细胞包括CART细胞（嵌合抗原受体工程化T细胞）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和其他转基因T细胞。近年来，细胞疗法领域已开始扩展，包括2017年推出的首个用于治疗血癌的CART细胞疗法，这是该领域的一个关键里程碑。^[1]尽管该领域蓬勃发展，但由于缺乏强大的体外模型在整个开发过程中评估这些免疫疗法，因此发现特异性增强T细胞对癌细胞反应的新型免疫疗法仍然是一项具有挑战性的任务。

过去，这些模型仅限于使用悬浮细胞和2D单层细胞。^[2]由于肿瘤异质性、免疫抑制微环境以及缺乏CAR-T细胞可识别的独特肿瘤抗原等问题，CART细胞在实体瘤中的应用一直滞后。

因此，筛选能够有效靶向和杀死肿瘤的CART细胞（例如使用CRISPR技术）是一个活跃的研究领域。^[3]

目前测定CART细胞诱导的细胞毒性的方法包括流式细胞术或基于图像的技术。此外，一些研究小组已经发表了关于T细胞与类肿瘤球体外相互作用评估的研究。^[4]

在这里，我们描述了一个生成3D肿瘤细胞球与T细胞共培养的工作流程，作为CART检测的概念验证模型。将活化的外周血单核细胞（PBMC）加入细胞球中，并使用高内涵成像随时间监测其活性。为了优化工作流程，我们开发了一种图像分析方法，该方法使用深度学习来准确分割目标对象，并使用机器学习仅通过明场图像量化球体中T细胞诱导的表型变化。

我们的结果表明，使用基于AI的分析工作流程来预测T细胞的疗效是可行的。我们首先训练了一个强大的深度学习模型来识别细胞球并生成整个细胞球及其边缘的掩膜。然后，使用机器学习方法从掩膜中提取的测量值对细胞球进行分类，与对照相比，观察到细胞球的表型明显变化，从而可以分析T细胞的疗效。为了进一步阐明哪些特征主导了分类，我们量化并比较了不同治疗组之间的面积、形状因子、总强度和灰度不均匀性等特征。

方法

在该研究中，我们比较了未经处理的细胞球（对照）、与未活化的PBMC混合的细胞球以及与活化的PBMC混合的细胞球的发育情况。

用已知能杀死细胞的星形孢菌素处理的球体作为另一个对照（图1A,1B）。

在72小时的培养过程中，每2小时通过延时高内涵成像记录T细胞与细胞球的相互作用。

3D细胞球：将Hela细胞系传代，并将Hela细胞接种到96孔圆底超低吸附板中形成3D细胞球（Corning cat#4515），密度为2000个细胞/孔，并在37°C下培养2天。

T细胞：从冻存的PBMC小瓶（ALLCELLS）中解冻T细胞。在接种到96孔细胞球板之前，T细胞用25ng/mLPMA和1μg/mL离子霉素活化6小时^[5]，并用CellTracker Green（ThermoFisher Scientific）标记，T细胞与Hela细胞的数量比例为10:1。

使用ImageXpress Micro Confocal高内涵成像系统和MetaXpress软件，通过透射光（TL）通道和荧光通道采集图像。使用10X物镜和10μm步进采集3D堆叠和2D投影图像，并在37°C和5%CO₂的环境控制下每2小时进行一次延时成像。MetaXpress软件6.7.2版本允许我们直接将延时（4D）模式下的3D堆栈保存为与IN Carta图像分析软件兼容的格式。

SINAP是一个基于深度学习的分割模块，用于训练自定义模型，以在所有时间点和处理条件下准确分割球体。该模型已使用超过50张注释图像进行了训练，以包含所有条件，并在微调模式下使用先前训练过的类器官基础模型训练了100个周期。请注意，如果没有可用的类似模型，可以使用默认模型作为基础模型，并通过加入更多训练集进行重新训练。可根据TL通道的2D投影生成掩模，以实现无标记分析。

随后，每个细胞球提取的测量值被用于生成Phenoglyphs模型（一种基于机器学习的分类工具），可将细胞球分类为5个类别。使用Pythonmatplotlib绘制了不同处理下关键特征的趋势图。

结果

为了解决T细胞体外评估的障碍，我们开发了一种图像。分析方法，通过使用高内涵成像和分析，在3D实验形式下研究T细胞与肿瘤细胞的相互作用（图1）。

使用Hela细胞形成细胞球。48小时后，将活化的PBMC添加到细胞球中，然后每2小时成像一次，持续3天（图3C-3K）。

共培养3天后，我们观察到在TL中成像的细胞球出现几种表型变化（图2）。所有处理组（除了用星形孢菌素处理的组）的球体都显示出尺寸（面积）和光学密度（变暗）的增加。与未活化的T细胞相比，我们还观察到在球体内存在更多的受活化T细胞（图3C-3J），同时球体边缘出现恶化（图2C和图5）。

为了改进基于T细胞检测的工作流程，我们开发了一种自定义分析流程，仅使用在明场中采集的图像来评估细胞球的表型变化。这种方法无需在培养前标记细胞，从而节省时间和试剂成本。TL通道（最佳焦平面）中的2D投影图像用于训练和生成SINAP模型以遮蔽细胞球区域。由于活化T细胞、非活化T细胞和无T细胞以及不同时间点（图2）的不同处理组之间存在变异性，因此对所有条件的图像都进行注释，以创建一个平衡的训练集。我们为细胞球和边缘创建了单独的分割掩膜，因为我们观察到与经处理的细胞球相比，未经处理的细胞球形成更平滑的边界（图3A-3C）。从生成的掩模中提取的测量值被用于Phenoglyphs（图4D）中，以生成一个用于球体分类的模型。与其他基于AI的分析类似，Phenoglyphs中的流程概述如下。

在Phenoglyphs中，首先使用聚类工具来标记适当的类别，然后再训练分类器模型。聚类工具依赖于选定的测量值，这些测量值可能与下一步用于训练分类器模型的测量值相同或不同。球体变得更暗且透明度降低（图2）这一事实表明，与强度相关的特征可能在球体聚类中起重要作用，这也反映在球体的成熟过程中。因此，我们比较了基于所有特征的聚类和基于强度相关特征的聚类，发现后者在不同条件下（尤其是晚期受活化T细胞条件（图4A粉色和青色标签）和晚期未受活化T细胞条件（图4B））给出了更好的聚类效果。然后，我们将训练集标记为5个类别，包括早期、中期、受活化T细胞晚期、未受活化T细胞晚期和无T细胞晚期，并在必要时重新分配图像，然后进行下一步。

排序工具会在聚类被手动标记后，根据显著性分数对所有测量值进行排序。我们选择了排名前20的测量值，并设定95%的相关性阈值，以避免最终分类器模型过拟合，随后使用该测量值子集进行模型训练。需要特别说明的是，此步骤使用的测量指标与聚类步骤中使用的指标不同。

训练完成的模型将应用于整个数据集，系统会展示新的示例图像集。此时我们可以选择将任意图像重新分配到其他类别，或忽略异常值。需要注意的是，所有测量数据均与图像中每个掩模相关联--当我们将图像重新分配至不同类别时，实际上是在将对应的测量数据重新归类至新类别。这种重新分配与训练的过程可能需要重复多次，直至获得满意结果（图4C）。

为了达到将球体正确分类到处理类别的目标，我们使用训练好的模型来预测最终时间点的所有球体。该模型准确预测了65个孔中的63个（图4E），预测准确率约为97%。因此，基于人工智能（AI）的无标记预测由T细胞浸润引起的球体演变是可行的，且具有很高的准确性。

如前所述，我们采用了基于机器学习的多参数分类器，这种方法的必要性源于检测环境的复杂性——在这种环境中，任何单一测量参数都不应主导分类结果。例如，虽然强度测量在特定场景下通过精细设定阈值可能有效区分图像，但在改变曝光时间等另一场景中就可能失效。因此，基于机器学习的多参数分类方法已成为表型分析中的通用解决方案。

然而，基于单一测量参数的趋势分析仍能揭示潜在的生物学现象，并有助于为未来类似实验的聚类步骤筛选关键测量指标。为此，我们进一步探究不同处理条件如何随时间影响细胞球的表型特征，从前20个重要特征中选取了四个核心参数——面积、形态因子、总强度和灰度不均匀性，并绘制了它们随时间变化的趋势图（图5）。本研究重点关注经活化处理的曲线（蓝色）与其他组别曲线的分化趋势。

总体而言，经活化处理的T细胞组在多个特征参数上均呈现出显著分化趋势：形态因子特征最早在22小时出现分化，总强度特征约在50小时开始分化，而灰度不均匀性特征的分化点出现在38小时。在受活化组与未受活化组之间，面积特征的差异最小。这些整体变化趋势与T细胞约在18小时开始浸润的现象高度吻合（图3C-3J）。

具体而言，经T细胞（包括活化组与未活化组）处理的球体在最初40小时内，其面积与阴性对照组基本相当；而40小时后，T细胞处理组的球体面积则显著大于对照组（图5A）。这种现象可能是由于T细胞（无论是否经过活化）的存在影响了球体结构的完整性。我们前期研究曾发现，在某些情况下，球体面积增大与三维结构的瓦解相关，最终导致孔板中出现松散聚集的细胞团。而经星形孢菌素处理的球体在培养过程中未呈现明显的尺寸变化，表明该处理有效抑制了球体的生长。

形态因子是表征物体圆度的指标，其取值范围为0至1，数值为1时代表标准圆形。图5B数据显示，通过student’s t检验，活化组与阴性对照组及星形孢菌素组相比，形态因子虽变化幅度有限但具有统计学显著性（p值分别为0.001和0.001）。该变化趋势符合我们的观察预期：经活化T细胞处理的球体边缘更不规则，形成边缘凸起结构（图3B），这与形态因子的测量结果相互印证。

总强度是另一个值得关注的特征参数。首先，总强度代表物体所有像素值的总和，因此通常预期物体尺寸越大，总强度值越高。我们的图5C结果与该理论预期一致，其相对变化趋势与图5A所示的面积变化具有相关性。其次，所有测量均在透射光通道中进行：结构越致密、透光性越差的样本会阻挡更多光线，导致像素值降低。这与我们观察到的现象相符——随着培养时间延长，球体逐渐变得不透明，这很可能与细胞密度增加有关。

最后，灰度不均匀性（GLNN）作为纹理特征指标之一，用于评估物体内灰度强度值的相似程度。该数值越低，表明强度分布越均匀。图5D显示，经T细胞处理的球体灰度均匀性最差，而星形孢菌素处理组的灰度分布最为均匀。

结论

• 我们使用延时高内涵成像来监测经T细胞处理的3D细胞球的生长和表型变化。

• 我们成功地生成了SINAP模型，并将掩膜应用于整个细胞球和细胞球边缘。

• 我们还训练了Phenoglyphs模型，将球体表型变化精确划分为5个类别。

• 通过四个关键特征的时序演化分析，为同类实验提供了可借鉴的特征选择依据。