使用稳定同位素标记和三重四极杆质谱技术实施靶向和标准化临床代谢组学指南

2026-01-30 13:27:39, 核磁同位素学社青岛腾龙微波科技有限公司

背景

代谢组学是“组学”研究领域中一个热门的分支，具有推动临床生物标志物、诊断和精准医疗新发展的潜力。然而，将这些发现向临床“转化”仍然困难重重，部分原因在于缺乏适用于大规模患者队列的标准化代谢组学方法。那么，稳定同位素内标物与靶向分析的联合使用能否弥补这一缺陷呢？三重四极杆质谱（QqQ MS）的持续发展如今能够实现前所未有的灵敏度、准确性和线性范围的全面代谢组分析。通过使用稳定同位素标记的内标物（IS）来补偿基质效应，可最大限度地提高这种分析能力，从而实现对生物样本更准确的比较，无论是在同一研究队列内部还是不同研究队列之间。本白皮书描述了靶向代谢组学的基础，从代谢物面板及其同位素内标物的选择，到使用适当的 QqQ MS 设置和质量控制（QC）措施进行分析。

稳定同位素标记标准品的重要性、设计与实施

为了促进基于质谱的代谢组学测量的准确性，以及实现批次间和实验室间的标准化，必须使用稳定同位素标记标准品。理想的方法是在实验样本和质量控制样本（例如混合基质，见下文）中精确添加标记标准品，以作为内标。这有助于研究人员评估基质效应和提取效率。只有使用内标，才能有效评估和校正样本、批次和仪器平台之间的回收率差异。在设计分析稳健的代谢组学方法时，内标的类型及其插入点是研究人员面临的两个关键因素。这对于评估检测的有效性以及在必要时指导纠正措施至关重要。

内标的性质可以有多种形式，但通常是一种或多种化合物，用一种或多种稳定同位素（常见的是 13C、15N 或 D）进行标记。这在研究设计中必须谨慎选择标记类型，因为这可能会受到所用的预分析和分析方法的影响。例如，如果选择 D 标记（这在新生儿筛查测试中很常见），则必须将标记插入非可交换位置，以减轻氢 - 氘交换的影响。由于化学稳定性，通常更倾向于使用 13C（或15N）标记而非氘标记，这有助于确保在整个实验方法中同位素保持完整。由于 13C（或15N）标准品具有出色的同位素稳定性，因此可以在样品制备的早期阶段插入。另外的好处是，在色谱分离过程中，这种类型的标记化合物与其相应的未标记代谢物（在特定基质中）共洗脱。这种共洗脱行为在纠正离子抑制和基质效应方面表现最佳。此外，13C（或15N）标准品在质谱仪的离子化和碰撞活化过程中不会受到同位素混乱或损失的影响。综合这些优点，13C（或15N）标准品在质谱应用中已被证明具有极大价值，应当在研究人员的设计过程中被视为首选标准品。

无论选择何种类型的同位素，代谢组学中的标记标准品理想情况下应与其未标记的对应物至少有 3 Da 的质量差。均匀标记优于位置标记，因为它在标记与未标记的质谱分析中为区分前体或产物离子提供了更多机会。这在选择 SRM 转换时特别有益，例如使用 QqQ 质谱仪时。

在使用前，同位素标记标准品必须经过良好表征（在化学或手性纯度以及同位素富集度方面），以便能够准确核算方法应用中的损失或误差。这涉及人为（例如移液）、化学（例如分析物提取、水解）或仪器（例如离子抑制、基质效应）误差。为了在应用中获得最佳结果，应在分析工作流程的早期阶段添加标准品，以便它们能够有效地校正实验各阶段可能出现的变异（图 3）。

关于需要的标记标准品数量，建议内标物的数量应与用户目标检测面板中的分析物数量相等。虽然对于小板来说这通常是可行的，但在处理大型板时（如本文所述的代谢组学方法），这会变得极其费力且成本高昂。在这种情况下，一种合适的方法是使用一组较小的稳定同位素标记内标物，这些内标物仍能代表所测代谢物的化学多样性。这些有标记的标准品可直接作为其未标记同类物质的内标。此外，对于那些没有直接标记类似物的代谢物，它们还可以充当“替代”标准品。只要替代品的洗脱时间与内源性样本中的天然目标物相似，从而具有相似的物理化学性质，这种做法在定量实验中就被认为是可以接受的。商业上可获得的 U-13C 标记代谢物酵母提取物（CIL 目录号 ISO1）提供了一种稳定来源的高同位素富集（≥98%，通过纵向高分辨质谱分析定义）的均匀标记 13C 代谢物。其中包含的数百种具有生物相关性的代谢物涵盖了广泛的代谢类别（例如氨基酸和有机酸、糖磷酸盐、辅酶）、生化途径（例如柠檬酸和乙醛酸循环、氨基酸和核苷酸代谢、戊糖磷酸）以及细胞/分子过程（例如免疫系统、血液凝固、DNA 代谢）。由于酵母是真核生物，其代谢物组成在很大程度上与人类代谢组相似，因此这种材料是用于人类研究的标记内标的良好且可接受的来源。除了其优势之外，这些高度浓缩的提取物还通过各种分析方法进行了表征和验证，这有助于其在代谢组学（从基础研究到临床转化）中的应用和标准化。在实验应用中，可在分析流程早期加入一定量的溶解的 U-13C 标记代谢物酵母提取物，作为其内源性类似物的有效内标。这些内标还可作为某些样本（如人类尿液）中缺乏直接内标的内源性代谢物的潜在替代物。这为在单次运行中使用单一、始终如一制备的产品来源最大化定量分析物的数量提供了有效手段。

大规模代谢物检测面板的 QqQ MS 优化

由于我们研究的重点在于更极性的代谢物，因此开发了一种基于 HILIC 的快速且稳健的质谱方法，用于一组极性代谢物的检测，能够基线分离异构代谢物（图 4）。在该实验流程中，使用来自 U-13C 标记代谢物酵母提取物的代谢物作为内标，提高了注释和定量的可靠性。

数据质量控制与标准化

确保数据质量对于准确解读和决策至关重要。特别需要考虑以下三个要素：

1. 确认液相色谱 - 质谱联用仪（LC-MS）的性能符合规格；

2. 在运行过程中监测数据质量，以检测分析问题，并查看是否需要进行信号校正，从而能够在运行内的样本之间进行比较；
3. 能够对来自不同液相色谱 - 质谱（LC-MS）批次的数据进行比较，这对于大型临床数据集的分析至关重要。

每个这些要素都可以通过特定样本进行评估，这些样本应包含在每一个 LC-MS 批次中：

1. 系统适用性样品——这通常是具有少量稳定代谢物的明确界定的样品，例如 CIL 的 QReSS 质量控制混合物（目录号：MSK-QReSS-KIT）中所含的那些。

2. 质控样品——这通常是该批次研究样本的混合样本，理想情况下应加入同位素标记的代谢物混合物（例如，CIL 的 QReSS 混合物），每8至10个研究样本后运行一次。使用混合质控样品的主要优势在于，它能够评估所研究的每种代谢物的保留时间和信号稳定性（图 6）。对于大批量样本，在运行过程中观察到一些信号损失的情况并不罕见，而质控样品数据可用于有效应用信号校正算法。

3. 参考样本——在每批实验中至少运行一次的样本。该样本的数据可作为“参考”，用于评估不同批次数据中存在的显著差异，从而判断是否需要批次校正。值得注意的是，使用稳定同位素标记的内标可减少批次校正的需求。
在代谢组学研究中，通常会在采集数据后进行数据标准化处理，以消除样本制备和液相色谱-质谱分析过程中引入的样本间差异。此外，标准化还可以校正临床样本中总代谢物丰度的差异。因此，我们尝试使用稳定同位素标记的内标（IS）的代谢物比率进行中位数标准化，而不是仅使用内源性代谢物峰面积（图 7）。由于稳定同位素标记的内标物与内源性代谢物受到相同的基质效应影响，它们的比值不受离子抑制效应的影响，因此使用比值进行归一化应会引入更少的误差。实际上，我们发现将代谢物与内标物的比值进行归一化优于标准归一化方法（图 8）。

结论

代谢组学的兴起为研究一组能够实时反映个体遗传、微生物组、生活方式和环境暴露综合影响的分子提供了一条充满希望的途径。因此，它有望为药物开发和诊断提供新的生物标志物，从而成为多组学努力中推动精准医疗的关键组成部分。要真正实现代谢组学的潜力，需要多种分析方法。除了基于高分辨准确质量数质谱（HRAM MS）的方法，旨在识别新的代谢物生物标志物和表征未知物质外，对于能够在大规模样本集、批次和实验室中实现标准化/定量分析代谢物特征的需求也在不断增长。正如本白皮书所述，采用稳定同位素标记标准品的三重四极杆质谱（QqQ MS）方法非常适合满足这一持续需求。

青岛腾龙微波科技有限公司作为美国剑桥同位素实验室CIL中国总代理，提供13C标记酵母提取物助力靶向代谢组学研究。