产品应用|聚焦AAV病毒载体，Repligen高通量纯化方案赋能工艺快速开发

随着基因治疗领域的快速发展，病毒载体生产行业正面临实现并优化大规模生产能力的核心挑战。与传统抗体纯化工艺相比，后者步骤稳健且基本通用，而病毒载体的纯化策略则因药物分子设计的细微差异而产生显著不同的结果。以AAV载体生产为例，若要将细胞与基因疗法（CGT）的适应症从罕见病拓展至更广泛的疾病领域，并开发更复杂、更脆弱的病毒载体，不仅需要扩大现有生产规模，还必须开发全新、更高效率的工艺方法。本文将介绍如何通过高通量实验设计，高效优化AAV亲和层析步骤，以满足病毒载体生产中低剪切应力、短停留时间等特殊工艺要求，从而应对传统平台方法难以解决的放大化生产难题。

Repligen 的AVIPure^® AAV亲和配基具有高亲和力和选择性，可高效去除宿主细胞和产品相关的杂质。它们是目前市面上唯一的在 NaOH 中稳定的AAV亲和配基，并通过多次循环使用证明了其稳定性，搭配OPUS^® 预装柱系列产品组合使用，范围已覆盖AAV2、AAV5、AAV6，AAV8 和 AAV9 等常见血清型，支持药物生命周期每个阶段的工艺开发过程。

本案例利用Tecan Freedom EVO系统与100 μL RoboColumn^®，开展高通量筛选，旨在确定最优清洗缓冲液以提升去杂效果，并筛选出符合pH3条件的洗脱方案。

根据清洗条件筛选结果（表1），尽管所有八种测试缓冲液（包括上样缓冲液）均实现了出色的产物纯度，但AVIPure^® AAV9推荐的标准缓冲液（0.5 M尿素和50 mM辛酸钠）在去除宿主细胞蛋白方面表现最优，显示了最高的HCP清除率。

图1. AVIPure^® AAV9 清洗条件筛选结果

为筛选洗脱缓冲液，本次实验在1 × 1014vp/mL 的上样量下，使用相同的 100 µL RoboColumn^® 平台进行。缓冲液测试组合包括：1 组 pH 2 的参考对照，以及 15 组含有各类添加剂的 pH 3 缓冲液。

洗脱缓冲液的筛选结果如图2。以条件1（pH 2）的回收率为对照基准，条件2（未添加盐的pH 3缓冲液）完全无法回收衣壳。虽然在条件3和4中引入NaCl使回收率有所提升，但仍需借助其他添加剂才能获得与pH 2条件相当的产率。最终发现，精氨酸、四甲基氯化铵（TMAC）、乙醇和乙二醇这四种添加剂，在pH 3条件下能显著提高产量。

图2. AVIPure^® AAV9 RoboColumn^® pH3洗脱条件筛选结果

考虑到乙醇的易燃性不利于安全储存，尽管其应用于部分生物制药工艺，我们仍将其排除。随后，使用其余三种高效添加剂配制了八种洗脱缓冲液进行实验。结果（图3）表明：条件3和4显示，仅需250 mM精氨酸即可实现近100%的衣壳回收率；然而，条件5和6显示，当乙二醇浓度从30%降至15%时，其效率显著下降。此外，鉴于下游工艺最可能衔接阴离子交换步骤，离子强度较低的乙二醇缓冲液因便于洗脱液直接上样而成为首选。

图3. pH 3 洗脱条件优化结果

为应对文献中关于低离子强度缓冲液可能导致AAV聚集的报道，我们在工艺验证运行前，专门测试了AAV9衣壳在乙二醇缓冲液中的稳定性。通过高性能SEC柱对纯化衣壳与含30%乙二醇的中和洗脱液进行分析，所得结果（图4）并未发现衣壳聚集的证据，因此该缓冲液被确认为首选。

图4. 纯化后衣壳（峰尖）和 30% 乙二醇中及洗脱液 HP-SEC 色谱图

首先，基于已确定的载量、清洗和洗脱条件，使用1 mL OPUS^® MiniChrom^®柱对剩余澄清裂解液进行验证运行。上样量设定为 2 × 10¹⁴ vp/mL（填料），即达到动态载量的80%。随后，采用选定的条件并分别控制1分钟（清洗）和4分钟（洗脱）的保留时间。最终结果（图5）表明，洗脱获得的衣壳纯度极高，宿主细胞蛋白与DNA分别被有效去除，降幅超过5个log和接近4个log。

综上所述，通过利用OPUS^® RoboColumn^®进行高通量筛选，我们得以用最少的样品和最高的效率，确定出合适的洗涤及洗脱条件。

图5. 使用 AVIPure^® AAV9 1 mL MiniChrom^® 柱验证最佳清洗及洗脱缓冲液结果

AVIPure^® AAV5填料在pH 2-3下洗脱率接近完全，是市面上唯一在pH > 2时仍能实现高回收率的商业填料，并具备在更高pH值洗脱的潜力。第二个案例研究即针对其（装载于OPUS^®预装柱）进行循环寿命评估。此外，图6所示的高通量洗脱筛选表明，结合RoboColumn^®与荧光检测分析，能显著提升检测分析效率。

乙醇、乙二醇和丙二醇作为添加剂能够实现在pH 4 下洗脱。

图6.  使用 AVIPure^® AAV5 RoboColumn^® 进行洗脱缓冲液筛选

AVIPure^® AAV5的循环寿命研究结果（图7）表明，在全部20个循环中，其性能保持高度一致。该研究使用1 mL OPUS^® MiniChrom^®层析柱，每次循环均上样至80% DBC。从色谱图可见，峰形几乎无变化，洗脱体积始终稳定在约2.5倍柱体积。

图7. AAV5 循环验证研究结果

Repligen（纳斯达克证交所代码：RGEN），中文名瑞普利金，是一家专注于生物工艺的全球化生命科学公司。自1981年创立以来，一直致力于为客户提供专业知识和技术创新。我们通过开发和商业化极具创新性的产品和灵活的解决方案，来帮助客户解决生物药生产过程中的关键步骤，从而推动生物工艺的进步。

Repligen总部位于美国马萨诸塞州波士顿，在美国马萨诸塞州、加利福尼亚州和新泽西州以及瑞典、法国、荷兰、德国和爱沙尼亚设有主要生产基地。