文献解读：基于QuantStudio™ Absolute Q数字PCR系统预测成人慢性粒细胞白血病患者稳定深度分子缓解

慢性粒细胞白血病（CML）的治疗已进入靶向治疗时代，其致病核心在于BCR-ABL1融合基因的异常表达。TKI药物的应用正是通过靶向抑制这一关键致癌蛋白而获得显著疗效，使多数患者获得长期生存。当前治疗的最终目标已转向追求治疗无缓解，即让患者在获得稳定深度分子缓解后安全停药，实现功能性治愈。然而，迈向这一目标的关键瓶颈在于：如何准确识别已达到足够深且稳定的分子缓解的患者？传统的分子监测"金标准"——RT-qPCR技术检测BCR-ABL1转录本水平，虽在CML管理中发挥重要作用，但在检测极低水平残留病灶时存在灵敏度限制，可能出现定量偏差，影响对深层缓解状态的精准判断，导致停药决策面临不确定性。

共纳入79例经一线TKI治疗后实现深度分子缓解（DMR）的CML患者，在持续相同治疗方案至少24个月的条件下，系统采集了从诊断初期至DMR后2年期间的多时间点外周血样本（Fig.1）。

所有样本均同步采用RT-qPCR与数字PCR进行平行检测，通过对比两种技术对BCR-ABL1转录本的定量结果，评估数字PCR在预测深度分子缓解稳定性及停药适宜性方面的临床价值。研究严格遵循伦理规范，完整记录了包括转录本亚型、TKI治疗反应及缓解动态在内的关键临床数据（Table 1）。

采用回顾性收集的RNA样本，所有样本均于-80°C规范保存。样本采集后，各中心使用NucleoSpin RNA plus试剂盒从外周血细胞中提取总RNA，提取的RNA立即通过Qubit RNA高灵敏度试剂盒定量，并直接用于RT-qPCR检测。

BCR-ABL1转录本定量采用全自动Xpert Ultra BCR-ABL1 Monitor™系统完成，以ABL1为内参基因进行校准，检测灵敏度达5.0（对应ABL1拷贝数>25万）。所有样本均严格按照国际CML微小残留病监测标准流程及厂商说明书操作。分子反应水平以BCR-ABL1 %对数化报告，其中0.1%、0.01%、0.0032%及0.001%分别对应MR3.0、MR4.0、MR4.5与MR5.0等级。不同深度分子反应对ABL1内参基因最低总拷贝数有严格要求：MR4.0需≥1万，MR4.5需≥3.2万，MR5.0需≥10万，该标准与是否检出BCR-ABL1无关。

BCR-ABL1的dPCR定量检测在QuantStudio™ Absolute Q数字PCR系统上进行。反应体系为9μl，包含1.8μl Absolute Q™ DNA数字PCR预混液（5X）、0.45μl预先建立的20X TaqMan-MGB-FAM探针预混液、5μl cDNA及1.75μl无核酸酶水。反应液加入Absolute Q MAP16板后加入15μl隔离缓冲液，经95℃预变性8分钟，随后进行43个循环（90℃ 15秒，60℃ 1分钟），最后60℃延伸2分钟。荧光信号与靶标定量数据通过配套软件进行分析。

研究采用描述性统计比较RT-qPCR与dPCR在MRD检测、DMR实现及其稳定性评估方面的差异，并分析两者与无治疗缓解潜力的关联。dPCR定义的DMR稳定性阈值设定为BCR-ABL1转录本<0.468拷贝/μL（基于前期研究）。时间变量以中位数和范围描述，分类变量根据数据特征采用卡方检验或Fisher精确检验。通过Kaplan-Meier生存曲线及log-rank检验，比较两种方法在不同时间关系类别（提前/同步/延后）中DMR持续时间的差异。

根据dPCR与RT-qPCR检测到深度分子缓解的时间关系，79名患者被分为三组：dPCR提前组占56%（44人），同步组占31%（25人），延迟组仅占13%（10人）。在此基础上，进一步评估各组患者在之后两年内DMR的稳定性（依据dPCR单独判断、RT-qPCR单独判断、两者共同判断或两者均未判断）。

DMR稳定性判定标准如下：

在dPCR提前或同步的87%患者中，有75%后续经RT-qPCR证实获得稳定DMR；而在dPCR延迟的少数患者中，高达80%出现DMR不稳定，两组差异具有高度统计学意义（p=0.0012）。时序数据显示，dPCR提前组中位达到DMR时间比RT-qPCR早8个月（10个月 vs. 18个月），而延迟组则晚11个月（36个月 vs. 25个月）。特别值得注意的是，在达到MR4.5/5.0等超深度缓解的患者中，dPCR提前预测了95%的病例。

分析结果显示e13a2、e14a2等不同BCR-ABL1转录本类型在dPCR提前、同步及延迟组中的分布无显著差异（Fig.4）。无论结合何种稳定性判定方式，转录本类型均未影响dPCR预测深度分子缓解动态的准确性，证明该技术具有稳定的检测性能。

无论患者接受伊马替尼（61%）或二代TKI治疗，dPCR在预测DMR时间方面表现一致：在两类药物中，dPCR提前/同步预测的比例分别为89%和84%，延迟比例分别为11%和16%（Fig.5）。统计分析证实DMR实现时间类别及稳定性均与TKI种类无显著相关性，表明dPCR的预测能力不受TKI药物类型影响。

研究结果显示，数字PCR不仅能更早、更可靠地评估治疗效果和缓解深度，且其预测能力不受不同BCR-ABL1转录本亚型影响。这些证据支持数字PCR应成为CML治疗监测的核心工具，建议从患者开始TKI治疗的早期阶段即整合应用。QuantStudio™ Absolute Q数字PCR系统凭借稳定的检测性能和简化的操作流程，非常适合在临床开展高灵敏度、高精准度的BCR-ABL1融合基因定量检测。未来仍需进一步推进检测流程和报告体系的标准化工作，以促进这一先进技术在临床实践中的广泛普及与应用。

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