QPix 文献解读——使用条形码索引 PCR 结合 HiFi 长读长测序绘制水稻全蛋白质互作组图谱

2025-09-22 14:15:35, 美谷分子仪器美谷分子仪器（上海）有限公司

背景介绍

蛋白质互作（Protein Protein Interaction, PPI）是生命活动调控的核心机制。构建蛋白质互作网络能加深对功能基因组学的理解。传统的研究方法很难实现高通量、可靠且成本低廉的蛋白质互作研究，这其中就包括酵母双杂交（yeast two-hybrid, Y2H），荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）、双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）等技术。

为研究水稻蛋白质互作组，华中农业大学张建伟团队与中国水稻研究所张健团队联合开发了 BIP-seq（Barcode-indexed PCR Coupled with HiFi Long-read Sequencing）技术，通过整合文库对文库酵母双杂交策略、双条形码索引 PCR 扩增和 HiFi 长读长测序，实现了水稻蛋白互作组的高通量、低成本鉴定。文章以“Global Protein Interactome Mapping in Rice Using Barcode‐Indexed PCR Coupled with HiFi Long‐Read Sequencing”为题于 2025 年发表于《Advanced Science》杂志。

研究方法及结果

研究人员开发的 BIP-seq（Barcode-indexed PCR Coupled with HiFi Long-read Sequencing）技术利用“库对库（library versus library）”的酵母双杂交策略快速获得数以万计的随机的阳性PPI互作组合酵母克隆。接下来通过两轮 Barcode-indexed PCR 将每个酵母克隆中 Bait 和 Prey 载体上的 cDNA 序列直接扩增，并在序列末端添加 2 套条形码用于判断克隆的来源。最后，通过 HiFi long-read 测序方法将数万个扩增子进行混合测序。具有完全相同的 barcode 的 Bait cDNA 和 Prey cDNA 表明它们来自相同的阳性 PPI 互作酵母克隆，即为互作组合（Fig1）。

Fig1. The workflow of BIP-seq technology

蛋白互作阳性克隆的挑取，Barcode-indexed PCR 及 HiFi 长读测序

将 Y187（含 bait cDNA 文库）和 Y2HGold（含 prey cDNA 文库）菌株以 0.8mL 等比例混合于 2L 灭菌烧瓶。50mL 2×YPDA 培养基，30℃ 震荡培养 20 小时（50rpm）。杂交后细胞用 15mL 0.9% NaCl 重悬，涂布于四缺培养基（SD/-Leu-Trp-His-Ade，含 5mM 3-AT）。30℃ 培养 7 天后，直径 1-2mm 的菌落判定为潜在蛋白互作阳性。用高通量微生物克隆挑选系统 QPix 420（Fig2）或手动的方式将蛋白互作的酵母菌单克隆挑取到含 10uL 新鲜 KBB 裂解液的 96 孔板中。100℃ 热处理 5min 后即可进行第一轮 Barcode-indexed PCR。

本次实验共设置了 6 个生物学重复，并且每个重复包含 10000 个随机 PPI 克隆。混合 60,000 个 PCR 产物进行 HiFi 长读测序，共获得 7.9 million reads。Barcode-indexed PCR 第一轮和第二轮的效率分别是 87.5%，81.3%。数据过滤后，每重复的有效 bait reads 为 8489.67±595.37，而有效 prey reads 为 8394.5±683.62，匹配的 bait 蛋白数量则为 817.67±105.76，prey 蛋白数量为 2959.83±163.82（Fig3）。

Fig2. QPix420 Colony Picking System

Fig3. The bioinformatic analysis pipeline and output of BIP-seq results on 60000 random PPI colonies

水稻 PPI 数据集

此次水稻 PPI 数据集被命名为 Rice PPI Dataset，即 RiPPID，其中包括 23032 条高置信度互作边（edges）连接 12741 个节点（nodes）（Fig4）。和此前的水稻 PPI 数据集比较，有 22665 条 PPI 是新发现的，极大地扩展了现有的水稻 PPI 数据集。

Fig4. The overall picture of RiPPID. The nodes represent proteins in RiPPID; the edges indicate PPI relationships; the modules indicate the nodes were classified in RiPPID with community detection. The various colors represent diﬀerent modules

结论

该研究通过技术革新的 BIP-seq 不仅实现了高通量的水稻蛋白互作组的发现，而且研究团队通过对很多细节的改进实现了经济、高效的蛋白互作组的发现，极大扩展了现有的水稻蛋白互作组的覆盖范围。

另外，该技术还可用于其他物种内或物种间蛋白互作组的探索，具有极高的通用性及应用价值。

关于美谷分子仪器

Molecular Devices 始创于上世纪 80 年代美国硅谷，并在全球设有多个代表处和子公司。2005 年，Molecular Devices 在上海设立了中国代表处，2010 年加入全球科学与技术的创新者丹纳赫集团，2011 年正式成立商务公司：美谷分子仪器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持续创新、快速高效、高性能的产品及完善的售后服务著称业内，我们一直致力于为客户提供在生命科学研究、制药及生物治疗开发等领域蛋白和细胞生物学的创新性生物分析解决方案。