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结合重亚硫酸盐的测序法实验流程(BSP) (Bisulfite Genomic Sequence) 原理:结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后,用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应(PCR)。 PCR产物中原先非甲基化的胞嘧***位点被胸腺嘧***所替代,而甲基化的胞嘧***位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。该方法特点是: 特异性高,它能够提供特异性很高的分析结果,这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的; 灵敏度高,可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。 结合重亚硫酸盐测序法技术实验流程 A. DNA制备 用DNA抽提试剂盒(Promega, cat. no. A1125)抽提组织,细胞培养物,石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。 B. 重亚硫酸盐处理 C. DNA纯化 用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。 D. DNA脱磺基反应 E. PCR扩增 F. PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化,随后连接到pGEM-T EASY 载体中克隆及测序。 甲基化特异性的PCR实验流程 (methylation-specific PCR, MSP) 原理:甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。重亚硫酸盐处理DNA后,基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。随后进行引物特异性的PCR。该方法引物设计是关键。MSP中设计两对引物,即一对结合处理后的甲基化DNA链(引物对M),另一对结合处理后的非甲基化DNA链(引物对U)。检测MSP扩增产物,如果用引物M能扩增出片段,则说明检测位点存在甲基化;若用引物U扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化(图3)。该方法优点是: 检测灵敏度高,样品消耗少,仅需1μg的基因组DNA,可用于石蜡包埋样本; 快速、简单,省时; 如果结合Real-time定量PCR技术(Taqman 探针)则能对样品中检测位点的甲基化水平进行定量检测(Methylight)。 MSP技术实验流程 A.DNA抽提 用DNA抽提试剂盒(Promega, cat. no. A1125)抽提组织,细胞培养物,石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。 B. 重亚硫酸盐处理 C.DNA纯化 用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。 D.DNA脱磺基反应 E.甲基化特异性的PCR反应 针对改变后的DNA序列设计两对引物(M,U),进行PCR反应。为了避免非特异性扩增用TaKaRa的hotstart酶。随后对PCR产物的凝胶电泳图进行分析。 实例: 检测肝癌细胞株Bel7405,Bel7404中SFRP1基因启动子甲基化。重亚硫酸盐处理后,针对改变的DAN序列设计两对引物 M: (forward: AGTTAGTGTCGCGCGTTC; reversal: CCGATACCCATACCGACTC) 299 bp U:(forward:GGAGTTGGGGTGTATTTAGTTTG; reversal: CCAATACCCATACCAACTCTACA) 247 bp, 扩增结果如图
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