结合重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）
（Bisulfite Genomic Sequence）
原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。 PCR产物中原先非甲基化的胞嘧***位点被胸腺嘧***所替代，而甲基化的胞嘧***位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。该方法特点是：
 特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；
 灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。


结合重亚硫酸盐测序法技术实验流程
A． DNA制备
用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B． 重亚硫酸盐处理
C． DNA纯化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D． DNA脱磺基反应
E． PCR扩增
F． PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化，随后连接到pGEM-T EASY 载体中克隆及测序。

甲基化特异性的PCR实验流程
（methylation-specific PCR, MSP）

原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。随后进行引物特异性的PCR。该方法引物设计是关键。MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的甲基化DNA链（引物对M），另一对结合处理后的非甲基化DNA链（引物对U）。检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化（图3）。该方法优点是：
 检测灵敏度高，样品消耗少，仅需1μg的基因组DNA，可用于石蜡包埋样本；
 快速、简单，省时；
 如果结合Real-time定量PCR技术（Taqman 探针）则能对样品中检测位点的甲基化水平进行定量检测(Methylight)。



MSP技术实验流程
A．DNA抽提
用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B. 重亚硫酸盐处理
C．DNA纯化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D．DNA脱磺基反应
E．甲基化特异性的PCR反应
针对改变后的DNA序列设计两对引物（M，U），进行PCR反应。为了避免非特异性扩增用TaKaRa的hotstart酶。随后对PCR产物的凝胶电泳图进行分析。
实例：
检测肝癌细胞株Bel7405，Bel7404中SFRP1基因启动子甲基化。重亚硫酸盐处理后，针对改变的DAN序列设计两对引物
M: (forward: AGTTAGTGTCGCGCGTTC; reversal: CCGATACCCATACCGACTC) 299 bp
U：(forward:GGAGTTGGGGTGTATTTAGTTTG; reversal: CCAATACCCATACCAACTCTACA) 247 bp,
扩增结果如图

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