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服务名称: 实时荧光定量PCR服务技术原理Real-time PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,zei后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术具有特异性强,有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点,做到PCR每循环一次就收集一个数据,建立实时扩增曲线,准确地确定Ct值,从而根据Ct值确定起始DNA拷贝数,做到了真正意义上的DNA定量。服务流程(含逆转录)1、RNA的提取2、DNase I 消化样品RNA 中的DNA3、RNA琼脂糖凝胶电泳4、RNA反转录为cDNA5、引物设计合成、探针设计合成(探针法)Real-Time PCR引物设计的要求① Tm=55~65 oC② GC=30~80%③ PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在80~300 bp之间都可。④ 引物的退火温度要高,一般要在60oC以上。选择特异性好,扩增效率高的引物。
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