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DNA甲基化检测
DNA甲基化是zei早发现的基因表观修饰方式之一,真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧***,即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧***转变为5’-甲基胞嘧***。DNA甲基化通常抑制基因表达,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关,比如在肿瘤发生时,抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加,CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态,导致抑癌基因表达的下降。
DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。
1. MassARRAY飞行时间质谱平台甲基化检测原理:
MassARRAY 分子量阵列基因分析系统EpiTYPER DNA甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应和MALDI-TOF测序原理。两者的完美结合使得该技术成为高准确性、高通量及高灵敏度的DNA甲基化定量分析手段。
MassARRAY分子量阵列基因分析系统EpiTYPER DNA甲基化分析技术是高通量DNA甲基化定量技术。实现多重CpG的甲基化位点的定位定量检测。配套的EpiTYPER软件为用户提供便捷的数据分析和报告工具。
1.1 飞行时间质谱原理:
质谱仪简单来说就是把不同的分子按照分子量进行排序的仪器。
我们的质谱是Maldi-Tof质谱,全称是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶,将该晶体放入质谱仪的真空管 , 而后用瞬时纳秒 (10-9s) 强激光激发,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子,产生的离子多为单电荷离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能,进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离,在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测,不同分子量的分子飞行时间也不同,分子量越大飞行时间越长,根据飞行时间进而判断分子量大小。通过对物质的分子量进行检测,达到区分、鉴别物质的目的。
1.2 利用飞行时间质谱检测甲基化原理:
实验从亚硫酸盐处理待测DNA开始。经过亚硫酸盐处理DNA中的未甲基化的胞嘧***(C)转变为尿嘧***(U),由此在DNA模板中产生了甲基化特异的序列变化。利用5末端带有T7-启动子的引物进行PCR扩增。产物经虾碱性***酸酶(SAP)处理后用于碱基特异性的酶切反应。酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化。配套软件EpiTYPER则能提供数字和图像注释工具,能将实验数据与客户提供的DNA序列相吻合。作为内在的质量控制机制,该系统还包括了基本统计学分析方法及数据可靠程度的评估手段,自动报告每个相应片段的甲基化程度。
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