技术应用|红曲产品中桔青霉素的检测

近期，日本有多人在服用小林制药公司生产的含红曲成分保健品后因肾脏疾病住院甚至死亡。此事件把日本百年药企小林制药，推上了风口浪尖。同时，也让红曲再次进入了大众的视野。

      关于红曲

红曲也叫红曲红、红曲霉、红曲米等，其作为一种天然发酵产物，其成分相对复杂，包括多种具有生物活性的物质。其用糯米蒸制后接种红曲菌种，发酵繁殖的，产品是发酵后的暗红色糯米，经粉碎后成为红曲粉。它在食品工业中应用十分广泛，南方做烧肉或豆腐乳多使用。

同时，红曲还具有降压降脂、活血化瘀、健脾消食的功效。在保健品和药品中也有广泛应用。

1、降压降脂：红曲可以降低血液黏稠度，提高血管舒张能力，恢复血管的弹性，降低血管的外周阻力，促进血压平稳下降。而且红曲中还含有他汀类物质，能降脂。所以红曲具有调节血压、降低血脂的功效。

2、活血化瘀：红曲可以活血化瘀，主治产后恶露不尽、瘀滞腹痛、跌打损伤。

3、健脾消食：红曲可以健脾消食，主治饮食停滞、胸膈满闷、消化不良或赤白下痢。

红曲的相关标准：

根据国家标准GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》及其增补公告，红曲米及红曲红作为着色剂可用于腐乳、碳酸饮料 、果冻、糕点、配制酒等多种食品中，其中风味发酵乳中的最大使用量不得超过0.8 g/kg，糕点中的使用量不得超过0.9 g/kg，焙烤食品馅料及表面用挂浆不得超过1.0 g/kg，其他允许使用的食品则可根据生产需要适量使用。

另外鉴于红曲中桔青霉素的危害，国家也设定了限量标准，GB 1886.181-2016《食品安全国家标准 食品添加剂 红曲红》中规定红曲红中桔青霉素的限量为0.04 mg/kg。

      桔青霉素亲和柱简介

参考《GB/T 5009.222-2016 食品安全国家标准食品中桔青霉素的测定》，样品经提取液提取、过滤、稀释，然后通过键合有桔青霉素特殊抗体的免疫亲和柱。此时，桔青霉素被亲和柱中的抗体特异性吸附，用水或缓冲液将免疫亲和柱上的杂质除去，然后用甲醇使抗体变性，从而将桔青霉素从亲和柱上洗脱下来。最后，用HPLC或液质方法进行定量检测。

桔青霉素亲和柱规格：

柱容量：100ng，

包装：25支/盒，

保存：2-8℃

保质期：18个月

使用对象

本方法适用于红曲制品、粮食、食品、饲料、调味品、药材和酒类等样品中桔青霉素的测定

实验溶液制备

1)      提取液，甲醇/水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水，混合均匀。

2)     pH7.0 PBS溶液：Clover pH7.0 PBS盐包（货号：C3001）：将盐包用1000ml纯水直接溶解，备用。保质期18个月。

3)      0.1%吐温 20-PBS 溶液:准确移取 1mL 吐温-20 以pH 7.0 PBS缓冲溶液定容至 1000mL。或10倍浓缩0.1%吐温PBS缓冲液（货号：G1112-C）直接稀释10倍使用。

4)      0. 1% 磷酸溶液:准确移取 1mL 磷酸加水定容至 1000mL。

5)      洗脱液 :甲醇-0. 1% 磷酸溶液( 70+30 ) 取70mL甲醇加30mL0. 1% 磷酸溶液( 70+30 )，混合均匀。

样品前处理：

1、红曲及其制品：

称取5g磨细的样品，置于250mL锥形瓶中，或匀质杯中。加入100mL甲醇/水（7+3）溶液。以均质器高速匀质提取2min。将提取物到入槽纹滤纸或普通滤纸上，滤液收集于干净的容器中。移取1mL上步的滤液，置于干净的容器中。用39 mL pH 7.0 PBS溶液：稀释，混匀。将上步稀释液通过玻璃微纤维过滤器，滤液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL准备上柱净化。

2、大米，玉米，辣椒等

称取10g磨细的样品，置于150mL锥形瓶中，或匀质杯中。加入50mL甲醇/水（7+3）溶液。以均质器高速匀质提取2min。将提取物倒入槽纹滤纸或普通滤纸上，滤液收集于干净的容器中。移取1mL上步的滤液，置于干净的容器中。用49 mL pH 7.0 PBS溶液：稀释，混匀。将上步稀释液通过玻璃微纤维过滤器，滤液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL准备上柱净化。

亲和柱净化程序：

将上步10 mL滤液，以1滴/秒的流速全部通过免疫亲和柱，直至空气进入到亲和柱中。用10 mL pH 7.0 PBS溶液或0.1%吐温 20-PBS溶液以1-2滴/秒的流速淋洗亲和柱。用1mL 洗脱液（甲醇-0. 1% 磷酸溶液70+30）以1 滴/秒的流速淋洗亲和柱，将所有样品洗脱液收集于玻璃测试管中，混匀，注入HPLC检测。

液相色谱条件：

色谱柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）

流速：0.8mL/min

检测器：荧光检测器，激发波长350nm,发射波长500nm;

进样体积：20~100uL

流动相1：0.1%磷酸:乙腈=35:65(V/V)

流动相2：流动相 A 液:乙腈，流动相 B 液:0. 1% 磷酸。

流动相及梯度洗脱条件见表

时间 /min

乙腈  /  %

0. 1% 磷酸  /  %

04060140607901099010104060154060

实验图谱及数据：

高效液相色谱仪桔青霉素标准品（50ppb)谱图如下：

红曲粉样品加标(2000ppb)谱图如下：

添加回收实验数据如下：

红曲粉样品1

红曲粉样品2

本底（ppb）

0.00

845

加标2000ppb

2026

2820

回收率

101%

99%